《Poultry Science》：Establishment of an inducible knockout model for the chicken Z-chromosome-linked gene DMRT1
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性别决定是动物发育过程中的关键生物学过程，由复杂的遗传调控网络控制。在家禽中，双性相关转录因子1（doublesex and mab-3 related transcription factor 1, DMRT1）在性腺发育及性别决定中发挥核心作用。为深入解析
性别决定是动物发育过程中的关键生物学过程，由复杂的遗传调控网络控制。在家禽中，双性相关转录因子1（doublesex and mab-3 related transcription factor 1, DMRT1）在性腺发育及性别决定中发挥核心作用。为深入解析DMRT1在家禽性别决定中的功能，研究人员构建了可诱导的DMRT1敲除系统，并对其效率及对性别相关基因和生理指标的影响进行了验证。为实现精准基因组编辑，研究人员筛选了多个靶向DMRT1基因位点的单链向导RNA（single guide RNA, sgRNA），并将最优序列整合至强力霉素（doxycycline, DOX）响应的Tet-on CRISPR/Cas9系统中。体外实验中，载体经细胞转染并以20 μg·mL-1DOX诱导，敲除效率达到80%。将聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）包裹的质粒注射入鸡胚后，研究人员在体内成功实现了该可诱导系统。定量分析显示DMRT1呈嵌合型敲除，效率可达45%。靶向破坏后，研究人员采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot, WB）检测性别相关基因及蛋白的表达变化，并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定雄性胚胎性腺在多个发育阶段（E4.5至E18.5）的睾酮水平。qRT-PCR结果显示，诱导后雌性相关基因（CYP19A1、FOXL2、ESR1）显著上调，雄性相关基因（DMRT1、SOX9、AMH）显著下调。WB结果表明，诱导后CYP19A1和FOXL2蛋白表达升高，SOX9蛋白表达降低。ELISA证实，诱导组雄性胚胎性腺睾酮水平较正常及未诱导雄性显著降低。本研究成功建立了鸡DMRT1可诱导敲除系统，该系统可有效调控性别相关基因表达并降低雄性胚胎睾酮水平，为培育新型性别可控育种材料提供了理论与技术支持。
该研究发表于《Poultry Science》，针对家禽生产中雌雄经济性状差异显著、早期性别鉴定与淘汰造成资源浪费的问题，围绕Z染色体连锁的关键性别决定候选基因DMRT1展开。由于传统CRISPR/Cas9系统在早期胚胎基因编辑中存在时间不可控、可能引发发育阻滞等问题，研究人员结合Tet-on可诱导系统与CRISPR/Cas9技术，构建了可在特定时间点启动基因敲除的平台，旨在精确解析DMRT1在鸡性别决定中的作用机制，并为家禽性别控制育种提供技术支撑。
研究中，样本来源于如皋黄鸡的受精蛋，研究人员采用双质粒策略分别携带可诱导Cas9表达盒和靶向DMRT1的sgRNA，通过体外细胞转染和体内胚胎注射实现基因编辑，并利用qRT-PCR、WB、ELISA等方法分析基因表达、蛋白水平及激素变化。
Establishment of An In Vitro DMRT1 Gene Knockout System
研究人员设计了三个靶向DMRT1外显子的sgRNA，经测序验证载体构建成功后，转染DF-1细胞，观察到显著的EGFP荧光信号，qRT-PCR和WB证实了Cas9和EGFP的高效表达，表明体外敲除系统构建成功。
Verification of the DMRT1 Gene Knockout System
通过荧光素酶-SSA活性检测和T7E1酶切实验，筛选出位于第2外显子的sgRNA1效率最高（74.07%），TA克隆验证其体外敲除效率达80%。将该系统注射入鸡胚后，体内敲除效率约为42%，并引起雄性性腺发育异常，左右不对称生长。基因表达分析显示，敲除后雌性相关基因CYP19A1、FOXL2、ESR1显著上调，雄性相关基因DMRT1、SOX9、AMH显著下调，睾酮水平下降。
Development of a CRISPR/Cas9-based DOX-inducible DMRT1 gene knockout system in vitro
研究人员将高效sgRNA克隆至可诱导载体，梯度DOX浓度测试显示20 μg·mL-1诱导效果最佳，敲除效率与组成型系统相当（80%）。诱导组细胞中性别相关基因表达发生显著变化，未诱导组与对照组无显著差异，验证了系统的可诱导性和特异性。
DOX-Induced CRISPR/Cas9 System Efficiently Knocks Out DMRT1 In Vivo
在体内实验中，DOX诱导组检测到Cas9表达显著升高，T7E1酶切和TA克隆证实DMRT1敲除效率为45%。诱导后雄性性腺出现卵巢样不对称性发育，性别相关基因表达变化与体外结果一致，睾酮水平显著降低。
讨论部分指出，DMRT1作为高度保守的性别决定因子，在脊椎动物睾丸发育中具有关键作用。本研究的sgRNA设计位置与既往研究不同，且在体细胞中实现了更高的敲除效率。与传统CRISPR/Cas9相比，Tet-on系统在时间控制上具有优势，可减少脱靶效应和发育干扰。研究人员建议未来可通过多sgRNA组合提高稳定性，并优化递送方式以提高体内效率，同时深入解析DMRT1下游调控网络。
结论部分强调，该研究确立了DMRT1在家禽性腺发生和性别分化中的核心地位，成功构建的化学诱导基因敲除平台可实现精准的时间控制，为家禽性别决定机制的解析及精准育种技术的开发奠定了坚实基础。
