综述：当前用于检测食源性细菌蛋白毒素的方法及新兴策略

《Talanta》：Current Methods and Emerging Strategies for the Detection of Foodborne Bacterial Protein Toxins

　　科马尔·法蒂玛（Komal Fatima）| 梅赫维什·伊克泰达尔（Mehwish Iqtedar）| 哈米德·赛义德（Hamid Saeed）| 罗希娜·阿卜杜拉（Roheena Abdullah）| 阿夫尚·卡利姆（Afshan Kaleem）| 马赫维什·阿夫塔布（Mahwish Aftab）
巴基斯坦拉合尔女子学院及大学生物技术系

**摘要**
食源性细菌病原体是全球疾病和死亡的主要原因，对全球经济也有重大影响。许多这类病原体会产生致命毒素，即使在没有活微生物的情况下，这些毒素仍可能存在于各种食品基质中，因此直接检测毒素对于食品安全监测至关重要。本综述重点介绍了五种主要的食源性细菌外毒素，这些毒素的选择基于其急性临床严重性、不同毒素类别的结构和机制多样性、相对于其他食源性蛋白质毒素而言已发表的大量检测数据，以及存在的持续未解决的检测挑战。这些主要毒素包括肉毒杆菌神经毒素（BnT）、志贺毒素（Stx）、霍乱毒素（CT）、李斯特菌溶素O（LLO）和葡萄球菌肠毒素（SEs）。每种毒素的作用机制都与其在三个目标类别（核酸、蛋白质、基于功能活性的方法）上的检测策略进行了综合评估。不同的商业检测平台以及新兴的研究驱动方法都经过了严格评估，重点关注分析灵敏度、特异性、功能相关性、处理时间和基质兼容性。研究表明，免疫测定和基于核酸的测试在常规监测中占主导地位，而先进的生物传感器和基于活性的方法则提供了更高的灵敏度和机制特异性。然而，仍存在一些关键挑战，例如基质干扰会系统性地降低实际食品样本中平台的性能；基因检测与生物活性毒素确认之间的脱节削弱了对热稳定毒素的风险评估；缺乏监管验证途径也阻碍了新兴平台的采用。未来的研究方向包括基于CRISPR的诊断技术、集成在智能手机上的便携式生物传感器、人工智能驱动的信号解释，以及标准化验证框架，以实现实验室创新向现场可部署的食品安全工具的转化。

**引言**
食物是人类生存的基本决定因素，提供了促进生长和代谢稳态所需的大量宏量营养素、微量营养素和生物活性化合物。其重要性不仅限于营养方面，还关系到世界的发展、经济体系和文化。因此，食品安全已成为一个全球性的公共卫生问题。然而，在生产链、国际贸易和储存设施日益复杂的背景下，确保食品安全仍然是一个主要挑战（食品安全研究所，2024年）。食品供应链可能在任何环节受到物理、化学或生物因素的污染。最常见的危险微生物污染物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫[2]。据报道，全球已发生多起食源性疾病暴发，造成了巨大的健康危机、经济压力和信任丧失。食源性疾病是一个备受关注的公共卫生问题，每年在感染、住院和死亡方面造成巨大负担。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）的长期监测数据，过去30年来食源性病原体的发病率呈现出相似的趋势[3]、[4]。例如，在美国，弯曲杆菌（Campylobacter）和沙门氏菌（Salmonella）是食源性细菌感染的主要原因，1996年至2024年的发病率约为每10万人15至25例（见图1A）。值得注意的是，2013年至2016年间志贺菌和弯曲杆菌的发病率增加反映了复杂的流行病学过程，这些过程涉及多种因素，如食品生产和消费行为[4]。CDC估计，每年有50万例感染是由细菌和原生动物食源性病原体引起的。沙门氏菌和弯曲杆菌是最常见的致病菌，导致最多的感染和住院病例；相比之下，李斯特菌的发病率较低，但死亡率较高。同样，志贺菌、产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）和隐孢子虫（Cryptosporidium）也会引起显著的发病率（见图1B）。

在食品基质培养过程中或定植宿主后产生毒素的病原菌是这些暴发的主要原因。这些毒素能够耐受加工条件，抑制胃肠道消化活动，并破坏宿主的生理过程，从而导致疾病症状。毒素大致可分为两类：外毒素和内毒素。当细菌死亡时，会释放内毒素，内毒素通常是由革兰氏阴性菌细胞裂解产生的脂多糖[5]；而外毒素则是革兰氏阳性菌主动释放的蛋白质或肽类物质。蛋白质毒素在外毒素中特别值得关注，因为它们结构复杂、毒性极高且具有生物活性，能够作用于神经元内部，阻止蛋白质合成、信号传导和细胞间通讯[6]。这些特性使得食品中的细菌蛋白质毒素成为食品安全和临床微生物学研究中的重要目标。肉毒杆菌（Clostridium botulinum）产生的肉毒杆菌毒素通过抑制神经递质的释放而导致弛缓性麻痹[7]、[8]；某些大肠杆菌菌株释放的毒素（包括志贺毒素）会阻止蛋白质合成，从而导致血管和肾脏损伤[9]。有效监测和治疗以及快速检测强效蛋白质毒素对于防止暴发、支持临床治疗和执行法律至关重要。已经开发了许多检测方法，并已投入使用，包括聚合酶链反应（PCR）等分子技术、酶联免疫吸附测定（ELISA）等分子免疫测定方法、生物传感器技术和色谱方法[10]、[11]、[12]。这些方法各有优缺点，取决于灵敏度、特异性、速度、成本以及适用于现场还是实验室环境[13]、[14]、[15]、[16]。然而，这两种方法都可能受到检测时间要求、操作复杂性、基质干扰或专用仪器限制的影响。此外，在混合食品样本中同时存在多种毒素仍然是一项艰巨的任务。

**先前研究综述**
Chadha等人（2022年）提供了基于生物传感器的食源性病原体概述，但没有整合毒素的作用机制、功能评估或针对每种毒素的转化障碍[17]。现有的单毒素综述分别介绍了不同毒素的流行情况和检测方法，但没有进行跨毒素比较[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。基于检测方法的综述按检测平台类型组织内容，但忽略了理解检测设计原理所需的特定毒素生物学背景[23]、[24]。本综述首次将五种主要的食源性细菌蛋白质外毒素整合在一个比较分析框架中，这些毒素的选择基于其临床严重性、监管优先级、机制多样性和持续的检测挑战。它对所有三种主要检测目标类别（核酸、蛋白质和基于功能活性的方法）进行了全面评估，分析了每种毒素在实地应用中的具体障碍，并提出了未来的发展方向。此外，本综述还讨论了这五种蛋白质毒素的作用机制，这对检测方法的发展和理解具有重要意义。例如，志贺毒素如何与Gb3（Globotriaosylceramide）受体结合，以及肉毒杆菌毒素如何与SNARE（SNAP-25）蛋白相互作用以阻断神经递质释放，这些机制细节对于提高检测方法的特异性至关重要。

**部分内容摘录**
**食源性细菌毒素**
细菌毒素是许多食源性疾病暴发的原因，由多种致病微生物产生。这些毒素在生物结构、稳定性和致病性方面存在差异，但它们都能在低浓度下引起显著的发病率和死亡率。了解这些毒素的特性（包括来源、病理生理效应和检测挑战）对于改进诊断策略至关重要。

**微生物毒素的检测方法**
有效检测食源性细菌外毒素需要平衡灵敏度、速度、成本和对不同食品基质的适应性。本节讨论了五种主要外毒素的检测方法：肉毒杆菌神经毒素（BnT）、志贺毒素（Stx）、霍乱毒素（Ctx）、李斯特菌溶素O（LLO）和葡萄球菌肠毒素（SEs）。这些检测方法分为三类：基于核酸的、基于蛋白质质量的和基于功能活性的。

**实验室创新与实地应用之间的转化差距**
尽管在检测灵敏度和平台多样性方面取得了显著进展，但实验室成果与实际食品安全应用之间仍存在差距。这一差距不仅反映了技术限制，还涉及结构、监管和操作方面的挑战。最普遍的转化障碍是基质不兼容性。大多数高灵敏度平台（如SERS生物传感器、电化学适配体传感器和SPR系统）在理想化缓冲液中的检测限（LOD）并不能直接反映实际应用情况。

**结论**
微生物毒素的检测技术已从传统的培养和免疫测定方法发展到现代的分子和生物传感器技术。现代诊断方法利用纳米材料和适配体生物传感器实现了更快的检测速度、更高的灵敏度和更广泛的应用范围。然而，免疫测定和基于分子的方法仍需进一步改进。

**作者贡献声明**
阿夫尚·卡利姆（Afshan Kaleem）：验证、软件开发；
罗希娜·阿卜杜拉（Roheena Abdullah）：撰写、审稿与编辑、可视化；
马赫维什·阿夫塔布（Mahwish Aftab）：撰写、审稿与编辑、项目管理；
科马尔·法蒂玛（Komal Fatima）：撰写初稿、方法学设计、数据整理；
哈米德·赛义德（Hamid Saeed）：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思；
梅赫维什·伊克泰达尔（Mehwish Iqtedar）：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、方法学设计、数据分析、概念构思。

**未引用参考文献**
[1]、[38]、[53]、[54]、[55]、[56]、[57]、[84]、[85]、[86]

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益冲突。

**数据可用性**
本研究的准备过程中未使用任何数据。

**关于生成式AI和AI辅助技术**
在撰写过程中，作者使用了Claude和Anthropic工具进行少量句子编辑和文本风格优化。使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审查和修改，并对发表文章的内容负全责。

**资金来源**
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何资助。

**利益冲突声明**
作者声明没有可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。