开发了两种用于测定药品中替普罗宁（tiopronin）含量的流动分析方法

《Talanta》：Development of two flow analysis methods for the determination of tiopronin in pharmaceuticals

　　

作者：Lea Kukoc、Maja Biocic、Tony G. Spassov、Spas D. Kolev

单位：斯普利特大学化学与技术学院分析与环境化学系，地址：Rudjera Boskovica 35，21000 斯普利特，克罗地亚

摘要

本文开发了一种流动注射分析（FIA）方法和一种顺序注射分析（SIA）方法，用于测定药品中的硫普罗宁（tiopronin）含量。这两种方法均利用一步颜色反应，即硫普罗宁将Cu(II)-bathocuproine复合物还原为橙色的Cu(I)-bathocuproine复合物，该复合物在483 nm处具有最大吸光度。FIA和SIA方法的线性校准范围分别为4.0 × 10^–7 - 4.0 × 10^–5 mol L^–1和4.0 × 10^–7 - 6.0 × 10^–5 mol L^–1，重复性（以相对标准偏差表示）分别为1.4%和2.9%，采样率分别为180次/h和36次/h。这两种方法的检测限和定量限分别为1.4 × 10^–7 mol L^–1和4.6 × 10^–7 mol L^–1。这些方法已成功应用于药品中硫普罗宁的测定。两种方法之间以及每种方法与药典标准方法及药品制造商提供的每片药品中硫普罗宁含量之间未观察到统计学上的显著差异。通过对添加了硫普罗宁的片剂样品进行测定，也获得了良好的回收率结果。根据采样率和试剂消耗量，可以得出结论：FIA方法由于具有更高的采样率，更适合分析大量样品；而SIA方法则能降低分析成本和化学废物的产生。

引言

硫普罗宁（也称为2-巯基丙酰甘氨酸，见图1a）是一种含有巯基的化合物，其氧化还原电位与其他巯基化合物相似，通常在-0.2至-0.3 V范围内。在碱性条件下，其还原活性增强，此时巯基脱质子形成更具亲核性和反应性的巯酸盐阴离子。由于其还原能力，硫普罗宁被用于医疗领域，主要用于治疗胱氨酸尿症（标签指示用途）[1]、[2]、[3]，也可用于治疗重金属中毒[4]以及类风湿性关节炎（非标签指示用途）[5]、[6]。胱氨酸尿症是儿童群体中肾结石（肾结石病）最常见的遗传原因，其特征是肾脏对胱氨酸的重吸收能力受损，导致尿液中胱氨酸排泄增加[7]。由于胱氨酸在正常尿液pH值下的溶解度较低，尿液中胱氨酸排泄量增加会导致尿液过饱和并形成胱氨酸沉淀，从而引发肾结石[7]。几十年来，硫普罗宁一直被用于治疗胱氨酸尿症，由于其良好的安全性，被认为是治疗儿童胱氨酸尿症的一线药物。与其他巯基结合药物（如D-青霉胺）相比，硫普罗宁的严重不良反应发生率较低（例如肾病综合征、骨髓抑制、严重的皮肤反应以及胃肠道和全身性副作用较少）[7]。硫普罗宁可将胱氨酸还原为两个半胱氨酸分子，并与半胱氨酸分子形成更易溶的混合二硫化物复合物[7]。硫普罗宁-半胱氨酸加合物在尿液中的溶解度更高，从而减少了胱氨酸结石的形成[8]。此外，硫普罗宁还能还原和螯合金属，使其以毒性较低的形式稳定存在。它可以与汞等重金属形成稳定的复合物[9]。在日本，由汞中毒引起的水俣病通过使用硫普罗宁（称为thiola）成功得到治疗[10]。在中国，硫普罗宁被用于治疗多种肝脏疾病（如脂肪肝、病毒性肝炎和药物性肝损伤）[11]、[12]。硫普罗宁的还原巯基对其肝保护和解毒作用至关重要，因为它能清除毒素和活性氧[13]。鉴于此，研究了硫普罗宁对严重烧伤患者的抗氧化保护作用[14]。由于硫普罗宁作为药物的重要性，文献中报道了多种用于测定药品中硫普罗宁的分析方法。

已经开发了多种批量仪器方法，采用不同的检测技术来定量测定药品中的硫普罗宁，包括分光光度法[15]、[16]、[17]、荧光法[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、化学发光法[24]、电化学发光法[26]、伏安法[27]和电位法[28]。其中许多方法需要繁琐和/或耗时的样品预处理，导致采样率较低。因此，这些方法不适合在线测定硫普罗宁。

基于动态流动技术的连续流制造工艺相比传统的批量工艺具有更高的操作灵活性，是制药生产中的有吸引力的替代方案[29]。这种制造方法需要持续监控，以确保关键工艺参数得到维持，并且产品质量不会随时间下降[29]。这种监控主要通过在线或内联配置实现。作为制造系统组成部分的分析仪器通常直接分析通过其集成流动检测器的连续工艺溶液[30]。在线配置中，定期使用自动化分析仪器分析工艺溶液的代表性样本。流动分析技术（如流动注射分析FIA和顺序注射分析SIA）适用于在线工艺监控和分析[31]。由于操作简便且采样率较高，FIA方法已成为制药质量控制的多功能且经济高效的工具[32]。这些技术通过减少废物产生和降低操作人员干预，促进了可持续的化学分析发展。

迄今为止开发的用于测定硫普罗宁的FIA方法使用了分光光度[33]、[34]、[35]、荧光[36]、[37]、化学发光[38]、[39]、[40]或安培[42]检测器。分光光度检测器因简单、易获得和成本低而在流动系统中被广泛使用。两种先前开发的基于分光光度检测的FIA方法分别采用了一步或两步氧化还原反应。在两步氧化还原反应中，分析物将Fe(III)还原为Fe(II)，然后在第二步中Fe(II)与2,4,6-三吡啶-S-三嗪形成有色复合物[34]。在一步氧化还原反应（方程式（1a）中，使用neocuproine（见图1b），硫普罗宁将Cu(II)-neocuproine复合物还原为有色Cu(I)-neocuproine复合物[35]。一步反应方法的采样率是两步反应方法的两倍。在最近的一项研究中，我们证明bathocuproine二磺酸盐（BCS，见图1c）在FIA[43]和SIA[44]测定N-乙酰-L-半胱氨酸乙酯（一种巯基化合物）时具有更高的灵敏度，两种试剂的化学计量比相同（方程式（1a）、（1b）：2RSH + 2[CuX₂]²⁺ ? RSSR + 2[CuX₂]⁺ + 2H⁺2RSH + 2[CuY₂]^2– ? RSSR + 2[CuY₂]^3– + 2H⁺其中RSH代表巯基分析物，X为neocuproine，Y为BCS。

顺序注射分析（SIA）由Ruzicka和Marshall于1990年首次提出[45]，是第二代基于流动的分析技术。作为FIA的更可持续替代方案，SIA基于可编程的连续流动原理运行，大大减少了试剂消耗，从而进一步降低了化学废物的产生和分析成本。据我们所知，目前尚无用于测定硫普罗宁的SIA方法。

本研究的目的是开发、优化并验证基于分光光度的FIA和SIA方法，用于测定硫普罗宁。在这些方法中，硫普罗宁在一步氧化还原反应中将Cu(II)-BCS复合物（[Cu(BCS)₂]^2–）还原为有色Cu(I)-BCS复合物（[Cu(BCS)₂]^3–，该复合物在483 nm处具有最大吸光度。

章节片段

试剂和溶液

所有溶液均使用分析级化学品和去离子水（Millipore，电阻大于18 MΩ）制备。10.0 mM的硫普罗宁储备液通过将81.6 mg的硫普罗宁（N-2-巯基丙酰甘氨酸，Sigma-Aldrich，美国）溶解在50 mL去离子水中制备。该储备液在4 °C下避光储存时可稳定长达1个月。工作溶液通过用去离子水稀释储备液每日制备。

pH值为5.0的醋酸盐缓冲液

流动系统参数的影响

在之前的研究中，使用[Cu(BCS)₂]^2–作为颜色试剂，通过FIA[43]和SIA[44]分光光度法测定巯基分析物N-乙酰-L-半胱氨酸乙酯时，发现当分析物浓度为0.040 mM或更低时（与本研究相同），最佳试剂浓度为0.400 mM。因此，在本研究中调查FIA和SIA系统的设计和操作参数时使用了该浓度。

初步SIA

结论

本研究开发的基于分光光度的FIA和SIA方法用于测定硫普罗宁，采用快速的一步氧化还原分析反应，具有宽的线性范围（4.0 × 10^–7-4.0×10^–5 mol L^–1和4.0 × 10^–7 - 6.0 × 10^–5 mol L^–1）、可接受的重复性（以相对标准偏差表示为1.4%和2.9%）、采样率分别为180次/h和36次/h，以及试剂溶液消耗量分别为3,000 μL和200 μL。这两种流动方法还具有低

CRediT作者贡献声明

Tony Spassov：撰写 – 审稿与编辑、资源获取。Maja Biocic：撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构思。Lea Kukoc：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。Spas Kolev：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金获取、正式文件撰写。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

其中一位合著者（Spas D. Kolev教授）是《Talanta》杂志的主编。

致谢

本研究得到了克罗地亚共和国科学与教育部、欧盟-NextGenerationEU（通过保加利亚共和国的国家恢复与韧性计划，项目编号BG-RRP-2.004-0008）、保加利亚国家科学基金（资助编号KП-06-H89/10）以及澳大利亚研究委员会和Northern Minerals Limited（合作资助编号LP210100244的支持。