《Frontiers in Amphibian and Reptile Science》：Methods for examining immune and skin microbiome associations with dermatomycoses in reptiles: a review
皮肤微生物组在真菌性皮肤感染（即皮肤真菌病）的免疫防御中发挥重要作用，此类疾病正日益影响全球爬行动物种群。多数爬行动物皮肤真菌病或新兴真菌病（Emerging Fungal Diseases, EFDs）与Onygenales目真菌相关，包括蛇类的Ophidiomyces ophidiicola感染（蛇真菌病）、蜥蜴类的Nannizziopsis感染及龟类的Emydomyces testovorans感染。目前分别针对Onygenales所致爬行动物皮肤真菌病的皮肤微生物组或免疫功能的研究逐渐增多，但同时探讨免疫与皮肤微生物组变化的研究仍十分匮乏。为推进未来整合性研究，研究人员综述了爬行动物皮肤微生物关联、免疫反应与皮肤真菌病的现有研究，涵盖皮肤真菌病的诊断与检测方法。文中简要介绍了已报道的爬行动物皮肤真菌病，讨论了皮肤真菌病的诊断与检测技术，描述了与特定皮肤真菌病相关的皮肤微生物组与免疫功能动态，并为未来整合免疫、皮肤微生物组分析与新兴疾病的研究提供了建议。
1 引言
过去25年间，全球野生动物中涌现出大量新型疾病，其中新兴真菌病占比显著。气候变化、农业扩张等环境干扰及全球贸易带来的长距离传播，推动其全球流行，典型代表如导致两栖动物种群锐减的壶菌病和蝙蝠白鼻病。相较于恒温动物，变温动物的体温环境更利于真菌病原体定植与感染（即真菌病）。Onygenales目真菌所致的新兴真菌病在圈养与野生爬行动物中均呈高发态势。
Onygenales目中Ophidiomyces、Nannizziopsis及Paranannizziopsis属真菌与爬行动物皮肤真菌病的关联日益明确。此类嗜角蛋白真菌可降解并利用角质，感染后常导致鳞片损伤，表现为皮损、鳞片增厚或变色，若累及口眼区域还会阻碍呼吸、视觉及相关摄食、运动行为；重症可发展为全身感染，引发嗜睡、呼吸困难甚至死亡。
皮肤真菌病破坏皮肤屏障与局部免疫过程，因此整合研究免疫与微生物组对评估其对种群的影响至关重要。目前爬行动物皮肤真菌病相关研究多独立开展微生物组或免疫学分析，二者整合研究极少，相关进展主要见于两栖动物领域，爬行动物中仅见肠道微生物组与免疫功能互作的相关综述。
爬行动物免疫学研究显示，其抵御病原体与损伤主要依赖先天免疫系统组分（如吞噬细胞、补体蛋白级联、天然抗体、抗菌肽）。针对真菌病原体的特异性免疫反应研究尚不充分，而爬行动物生态免疫学正逐步发展，强调通过血液学、功能免疫测定、分子检测及免疫-内分泌指标，研究病原体等生态胁迫下的爬行动物免疫应答。
皮肤微生物组介导的免疫防御可能影响爬行动物皮肤真菌病的进展。作为抵御病原体的首道防线，皮肤微生物组被视为免疫应答的组成部分：既可预启动宿主免疫系统以应对病原体入侵，也可在入侵后进一步调控免疫反应；其信号可驯化免疫系统并优化后续应答策略，但慢性重度刺激也可能诱导免疫抑制与细胞毒性。此外，共生微生物可通过干扰竞争、资源竞争、捕食等互作抑制皮肤癣菌定植，或通过互利作用促进其定植。
环境扰动与致病微生物入侵可导致皮肤微生物组失调，削弱对皮肤癣菌的防御能力。爬行动物皮肤微生物组对环境扰动的响应研究较少，但两栖动物研究显示气候变化与栖息地干扰均可改变其皮肤微生物组组成。条件致病菌可利用应激导致的多样性下降、代谢产物互作、传播辅助、特定定植信号及免疫抑制等机会建立感染；而感染后康复个体的微生物组可被“驯化”，形成更强的防御能力（即适应性微生物组假说）。
综上，皮肤微生物组与免疫系统的互作在爬行动物皮肤真菌病发生发展中具有重要地位，但三者交叉研究极为匮乏。本文系统梳理了爬行动物新兴皮肤真菌病相关的皮肤微生物组与免疫应答研究，首先介绍主要EFDs（Box 1），随后综述相关皮肤微生物组与免疫应答的现有文献，重点聚焦皮肤真菌病的检测诊断技术及微生物组、免疫关联表征技术，旨在为未来整合两类技术的爬行动物皮肤真菌病研究提供参考，助力濒危爬行动物种群的保护与管理。
2 材料与方法
为明确爬行动物Onygenales皮肤真菌病相关的皮肤微生物组与免疫指标研究现状，研究人员检索了同行评审论文、未发表的硕士与博士学位论文，纳入标准包括：1）研究爬行动物皮肤真菌病与皮肤微生物组；2）研究爬行动物皮肤真菌病与免疫功能；3）同时研究爬行动物皮肤真菌病、皮肤微生物组与免疫功能。具体检索与筛选流程详见补充材料。
3 结果
共纳入12项研究（含2篇硕士论文）分析爬行动物皮肤真菌病与皮肤微生物组的关联，15项研究（含3篇硕士论文）分析其与免疫功能的关联，未发现同时整合皮肤微生物组与免疫学的已发表论文（仅见1篇相关硕士论文）。多数研究聚焦于蛇类蛇真菌病（曾用名），少数涉及龟类、蜥蜴类与短吻鳄。
表1汇总了相关研究采用的技术流程、实施机构与研究物种。皮肤微生物组表征主要采用测序技术，包括短读长（如Illumina）与长读长（如ONT纳米孔）测序；生物信息学分析涵盖多样性分析、差异分析、功能分析与共现网络分析。免疫表征主要包括免疫细胞分析（如白细胞分类计数、异嗜细胞与淋巴细胞比值）、蛋白电泳、急性期蛋白检测、微生物杀伤试验、酶活性分析及皮质酮检测（内分泌分析）。
表2汇总了既往研究中用于表征皮肤微生物组的α多样性指标，包括丰富度、香农多样性、香农均匀度、Inverse Simpson指数与Chao1丰富度。不同研究结果存在差异：如蛇类接种Ophidiomyces ophidiicola后细菌丰富度呈先升后降的非线性变化，溃疡个体较非溃疡个体丰富度降低；而海蛇溃疡与非溃疡个体的真菌丰富度无显著差异。香农多样性在感染蛇类中多呈下降或非线性变化，蜥蜴类溃疡个体则显著降低，龟类壳病变样本反而升高；真菌香农多样性在感染蛇类与溃疡蜥蜴中均呈下降趋势。
3.1 病原鉴定
爬行动物皮肤真菌病病原鉴定常用两类方法：1）病灶取样培养结合菌落形态学鉴定；2）培养分离后通过Sanger测序鉴定分离株。
培养与形态学鉴定曾是主要诊断手段，但因形态相似类群难以区分，目前已多与分子技术联用。Sanger测序可实现更高分类分辨率，已成功将旧称“Nannizziopsis vriessi的Chrysosporium无性型（CANV）复合群”拆分为Ophidiomyces、Nannizziopsis与Paranannizziopsis等多个属种，并被用于验证科赫假说，明确O. ophidiicola为蛇真菌病病原、Nannizziopsis guarroi为鬃狮蜥黄真菌病病原等。
未来研究可应用新一代测序（NGS）与长读长测序技术，无需预培养即可直接分析提取DNA中的微生物群落，减少培养偏好性带来的偏差。例如Illumina测序已被用于对比疑似皮肤真菌病与健康鬃狮蜥的皮肤拭子微生物丰度，成功锁定Nannizziopsis属为病原，并发现其与细菌、真菌的共存与互作关系。
3.2 宿主感染诊断
爬行动物皮肤真菌病的诊断方法包括四类：1）症状检查；2）感染组织组织学检查；3）聚合酶链式反应（PCR）与定量PCR（qPCR）；4）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
症状检查是最基础的现场与实验诊断方式，最常见记录为皮损，评估尺度从有无记录到详细的分级量表不等，还可记录嗜睡、行为改变等全身症状。组织学检查可判断真菌是否侵入皮下组织，典型特征为皮肤组织内出现平行壁、横隔、频繁分支的无色透明菌丝，伴有关节孢子。PCR与qPCR常与组织病理学联用，通过扩增皮肤组织、拭子或蜕皮的DNA检测病原，目前已建立针对O. ophidiicola、Paranannizziopsis属、Nannizziopsis属与E. testavorans的标准化qPCR方法。MALDI-TOF MS通过将培养分离株与基质共结晶后经激光电离，根据质荷比分离粒子生成特征谱图实现鉴定，无需预设遗传靶标，但近缘种谱图相似性高，且数据库覆盖有限，已成功用于鉴定N. guarroi等Onygenales真菌。
现有研究强调需整合多方法区分“病原体表定植”与“真性皮肤真菌病”。例如蛇真菌病的四等级分类体系，将“确诊”定义为PCR/qPCR/培养检出O. ophidiicola且组织学观察到特征性菌丝与关节孢子。
3.3 皮肤微生物组表征
爬行动物皮肤微生物组研究通常包括取样（皮肤拭子或蜕皮）、DNA提取、测序与下游分析。测序策略分为靶向短读长测序与靶向长读长测序两类。
短读长测序以Illumina测序为主流，多采用细菌16S rRNA基因与真菌18S-ITS1/ITS2区引物扩增，输出150-300 bp序列，聚类为操作分类单元（OTUs）或解析为扩增子序列变体（ASVs）。目前相关研究多采用OTUs以提升跨研究可比性，仅1项研究采用ASVs，后者对稀有类群的解析能力更强。长读长测序应用较少，主要包括牛津纳米孔（ONT）测序与PacBio连续长读长（CLR）或HiFi测序。ONT MinION测序仪便携性强，适用于野外场景，可并行输出平均23 kb的长读长序列，已被用于对比加拉帕戈斯巨龟感染与未感染Aphanoascella galapagosensis的壳部细菌组。PacBio HiFi测序于2019年推出，通过环形一致性测序（CCS）输出10-25 kb读长，准确率可达99.9%，有望更精准地解析病原菌株、复杂微生物组结构与功能。
微生物组多样性分析多采用α与β多样性指标。α多样性最常用香农多样性指数（综合丰富度与均匀度）、总类群数与Chao1丰富度（估算稀有类群），β多样性多采用布雷-柯蒂斯相异度。研究显示蛇类接种O. ophidiicola后细菌丰富度随病原载量升高呈先升后降的非线性变化，提示操控实验可揭示微生物组变化的驱动机制。单一多样性指标表征能力有限，后续研究可补充Inverse Simpson、加权/未加权UniFrac、Raup-Crick相异度等指标，后者可排除丰富度变异对β多样性的影响。
差异分析用于识别“患病”与“健康”表型间丰度显著不同的微生物类群，常用方法包括DESeq2（校正测序深度与过度离散）、微生物组成分析（ANCOM，控制假发现率）与线性判别分析效应量（LEfSe，挖掘生物标志物）。不同研究中与疾病状态相关的核心类群存在差异，但Paracoccus、Chryseobacterium与Pseudomonas属在多项研究中被报道。
共现分析通过网络或概率模型识别与病原共发生的微生物类群，例如研究发现鬃狮蜥感染性Nannizziopsis种与41种细菌呈正相关，包括Salmonella enterica、Clostridiales目物种与Cladosporium属真菌。传统参数模型难以刻画复杂微生物互作，非参数方法与深度学习模型可提升路径生物组解析能力。
功能分析可直接通过体外功能试验或间接预测实现。已有研究通过体外试验验证了爬行动物皮肤真菌病相关微生物的抗真菌与抗菌活性；也有研究采用PICRUSt工具基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库预测细菌功能通路，或利用BugBase与FUNGuild数据库注释微生物功能性状。短读长测序的分类分辨率限制功能预测准确性，长读长测序可改善这一问题，未来还可结合宏基因组鸟枪法测序直接匹配功能数据库。
未来皮肤微生物组研究可结合体外与离体实验验证互作机制，并联合宿主代谢组学、转录组学等多组学技术，阐明宿主-微生物组互作的分子机制，为生物强化等管理策略提供依据。
3.4 免疫功能表征
爬行动物皮肤真菌病相关免疫功能研究可分为四类：1）白细胞定量（白细胞分类计数）；2）蛋白定量（血浆蛋白电泳或急性期蛋白检测）；3）功能试验（微生物杀伤试验、溶血试验、酶活性测定）；4）行为反应观察。同时可检测内分泌指标（如异嗜细胞与淋巴细胞比值、皮质酮浓度）以关联能量动员与应激水平。
白细胞分类计数多以100个白细胞中各类型占比表示，研究显示不同物种的白细胞应答存在差异：西部池塘龟壳病症状个体嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞计数升高，感染O. ophidiicola的伊利湖水蛇总白细胞计数升高，皮损个体嗜天青颗粒细胞比例升高、淋巴细胞比例降低。流式细胞术可通过激光散射特性高通量鉴定血细胞亚群，在爬行动物皮肤真菌病研究中尚处于起步阶段。
异嗜细胞与淋巴细胞比值（HL比值）常与白细胞计数联用，反映应激激素皮质酮（CORT）介导的循环白细胞重分布。研究显示草原响尾蛇接种O. ophidiicola后，20℃环境下HL比值随症状加重而升高，26℃环境下无此变化；西部池塘龟的HL比值与壳病状态无关，但与饲养环境相关。
血浆蛋白定量通过蛋白电泳与急性期蛋白（APP）检测炎症、感染或组织损伤相关蛋白。蛋白电泳按大小与电荷分离蛋白，定量白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白与γ-球蛋白组分；APP检测则通过免疫吸附试验（如ELISA）精准定量特定蛋白。研究发现O. ophidiicola阳性东部马萨加响尾蛇γ-球蛋白比例升高，疫源地个体总蛋白、白蛋白、γ-球蛋白、白蛋白/球蛋白比值降低，C反应蛋白升高；患炎性皮肤感染的绿鬣蜥白蛋白/球蛋白比值降低，α、β、γ-球蛋白升高。
微生物杀伤试验（MKAs）用于量化补体等先天免疫组分的杀菌能力，多采用冻存血浆或血清与特定微生物共孵育后定量生长情况。爬行动物皮肤真菌病相关MKAs多使用大肠杆菌模型，尚未见针对爬行动物特异性皮肤真菌病原的MKA研究，但已有研究采用念珠菌（Candida albicans）模型揭示真菌激活的补体与凝集素途径免疫机制。
溶血试验用于评估补体与自然抗体（NAbs）的功能互作，通过检测血清对外源红细胞的裂解最高稀释度量化活性。研究显示伊利湖水蛇的NAb-补体介导溶血活性随圈养时间升高，但与疾病严重程度无关。
酶活性测定可反映免疫相关酶的变化，研究显示轻度蛇真菌病个体几丁质酶（巨噬细胞产生的几丁质降解酶）活性高于重症个体；蛇皮肤真菌病相关细菌分离株中6/15株表现出凝固酶活性。
行为/发热反应研究显示，感染O. ophidiicola的东部带状蛇更快达到偏好体温，且未暴露过病原的个体选择更高底物温度；感染蛇也更倾向在活动季末期于地表晒背，而非进入越冬生境。
皮质酮定量用于解析免疫与其他生理过程的权衡，放射免疫分析法（RIAs）为金标准但成本高，ELISA成本较低但精度稍逊。研究显示患皮炎的美洲短吻鳄皮质酮应激反应升高，冬季感染O. ophidiicola的侏儒响尾蛇皮质酮水平与症状严重程度正相关，接种脂多糖（LPS）后皮质酮升高，但部分研究中感染个体的基础皮质酮与捕获应激反应与健康个体无差异。
未来免疫功能研究可结合体外模型（如外周血单个核细胞刺激试验）与免疫基因调控分析（如转录组学），目前爬行动物皮肤真菌病的免疫组学研究极少，仅1项研究通过转录组学鉴定了草原响尾蛇接种O. ophidiicola后的潜在免疫应答基因，整合免疫、皮肤微生物组与多组学技术将深化对三者互作机制的理解。
3.5 结语：整合皮肤微生物组与免疫指标
整合研究皮肤微生物组与免疫功能，可更全面评估面临新兴真菌病的爬行动物健康状态。现有研究多聚焦蛇类，未来需拓展至蜥蜴、龟类等类群，结合长读长测序、非参数生物信息学分析与免疫应答检测，在多尺度上解析关联特征，并整合至景观风险预测模型，为脆弱种群的保护管理决策提供科学依据。
