基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a辅助技术的粪肠球菌快速检测

《Microbiology Spectrum》：Rapid detection of Enterococcus faecalis using RPA-CRISPR/Cas12a-assisted technology

　　

粪肠球菌(Enterococcus faecalis, E. faecalis)是一种机会性致病菌，可引起尿路感染、血流感染、感染性心内膜炎及脑膜炎等多种威胁生命的感染性疾病，是医疗保健相关感染的主要病原之一，其全球流行率持续上升，与抗生素过度使用驱动的多重耐药问题密切相关。因此，快速准确的检测对及时治疗和改善预后至关重要。本研究以E. faecalis的pheS基因为靶标，采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术实现靶序列的快速扩增，并通过成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)系统完成检测。Cas12a-crRNA复合物特异性识别扩增产物后，触发单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)报告探针的非特异性切割，产生荧光信号，该信号可在实时荧光定量PCR系统中定量检测，也可直接在紫外光下目视判读。经对RPA引物、反应条件、crRNA序列及crRNA/Cas12a配比等关键参数优化后，该方法在较短检测周期内实现10?2ng/μL的检测限，且与其它常见病原体无交叉反应；临床分离株及加标样本的检测结果与PCR/实时荧光定量PCR(qPCR)结果完全一致，证实其高可靠性。综上，本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏、特异、可靠，操作简便、设备要求低、成本效益高，有望成为E. faecalis临床快速检测的有力工具。

本研究发表于《Microbiology Spectrum》，针对粪肠球菌(E. faecalis)这一导致医疗保健相关感染的核心机会性致病菌展开。粪肠球菌可产脂磷壁酸、明胶酶、丝氨酸蛋白酶、肽聚糖、细胞溶素等多种毒力因子，黏附定植与致病能力较强，占肠球菌感染的60%，在高收入国家感染性心内膜炎病因中占比超90%，也是仅次于金黄色葡萄球菌的脑膜炎第二大病原，且多重耐药株流行率随住院时间延长、免疫低下人群增多及抗生素滥用持续上升，显著推高治疗成本与病死率。现有常规检测方法存在明显局限：细菌分离培养耗时长且依赖培养基类型，酶联免疫吸附试验(ELISA)成本高、交叉反应明显，PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)等分子技术灵敏度与特异性优异，但依赖昂贵仪器、复杂流程与严格实验室条件，难以满足基层与即时检测需求。新型等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)虽适配简易加热设备、操作简便，但RPA易产生非特异性扩增导致假阳性。CRISPR-Cas系统因速度快、灵敏度与特异性高成为核酸检测重要平台，其中Cas12a在crRNA引导下识别富含T的原间隔序列邻近基序(PAM)后，先顺式切割靶标双链DNA(dsDNA)，再激活反式切割活性非特异性切割单链DNA(ssDNA)报告探针，释放荧光信号，但单独检测效率有限，需结合预扩增步骤。已有研究将RPA与CRISPR/Cas12a联用开发DETECTR系统，成功应用于多种病原体检测，针对粪肠球菌的相关检测虽有报道，但或依赖Cas13a系统及纳米材料与近红外激光设备，或仅作为其他检测方法的阴性对照，尚未形成简便、低成本、适配资源有限场景的专用检测方法，因此本研究旨在建立基于RPA-CRISPR/Cas12a的粪肠球菌快速核酸检测方法，为临床早期识别感染、指导抗菌药物合理使用提供实用工具。

研究人员采用的关键技术方法包括：以广东某医院提供的12株临床粪肠球菌分离株、6种其他常见病原菌及19份健康成人尿液样本为研究对象，靶向粪肠球菌pheS基因设计RPA引物与crRNA，通过原核表达系统制备LbCas12a蛋白，分别建立RPA等温扩增体系与CRISPR/Cas12a切割检测体系，系统优化反应温度、时间、试剂浓度等参数，通过交叉反应实验评估特异性，梯度稀释核酸评估灵敏度，并以临床分离株与加标尿液样本为对象，与传统PCR/qPCR进行一致性验证。

研究结果如下：

一、RPA检测体系的建立与优化。研究人员设计7对RPA引物，经扩增产物琼脂糖凝胶电泳筛选，F5/R5引物扩增效率最优、无非特异性产物；进一步对反应条件优化，最终确定40℃扩增40分钟为最佳条件，兼顾检测速度与信号强度。

二、CRISPR-Cas12a检测体系的建立与优化。研究人员设计2条靶向pheS基因的crRNA，实时荧光监测显示crRNA-1的荧光强度约为crRNA-2的2倍，选择crRNA-1构建检测体系；进一步对Cas12a蛋白与crRNA的浓度组合优化，确定30 nM Cas12a与10 nM crRNA为最佳配比，获得最强荧光信号。

三、RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性与灵敏度。特异性验证显示，仅粪肠球菌样本产生强阳性荧光信号，6种其他常见病原菌及阴性对照均仅见本底荧光，无交叉反应；灵敏度测试显示，方法对粪肠球菌基因组DNA的检测限达10^?2ng/μL，低于该浓度时信号显著下降。

四、临床菌株检测。12株不同来源的粪肠球菌临床分离株经本方法与常规PCR同步检测，均为阳性，两种方法结果完全符合，证实方法对临床分离株的检测能力稳定可靠。

五、临床样本检测。10份加标尿液样本（终浓度1×10⁵CFU/mL）与9份阴性尿液样本经本方法与qPCR同步检测，加标样本全部正确判为阳性，阴性样本全部正确判为阴性，两种方法结果完全一致，证实方法在临床样本场景中性能与qPCR相当。

讨论部分指出，本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法全程可在2小时内完成，检测限达10^?2ng/μL，无交叉反应，结果可通过实时PCR仪定量或紫外光目视判读，适配即时检测(POCT)。与已有同类研究相比，首次选用pheS基因作为靶标，无需转录步骤即可直接检测DNA扩增产物，且仅需基础实验室设备，更适配资源有限场景。但研究仍存在局限：方法为定性或半定量，不具备qPCR的精准定量能力；临床验证以加标样本为主，真实临床样本量不足，未覆盖血液等多类型样本；RPA扩增与CRISPR切割分步进行，开管操作存在气溶胶污染风险。未来需扩大真实临床样本量，优化为一锅式反应体系，推动技术向临床应用转化。

研究结论为：本研究建立了一种快速、特异、设备适配性强的粪肠球菌RPA-CRISPR/Cas12a检测 assay，为这一重要病原的早期识别提供了实用工具，有望缩短临床与资源有限场景的诊断周转时间，后续向一锅式体系开发与扩大临床验证推进，是其转化应用的重要方向。