《Microbiology Spectrum》：Integrative analysis of metabolome and transcriptome reveals new insights into the formation and regulation of major components of G. leucocontextum and G. lucidum
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灵芝是一类具有多种药用功效的药用真菌，其中三萜类化合物是其主要药理活性物质之一。本研究以两个灵芝物种（新发现物种白肉灵芝 Ganoderma leucocontextum与传统药用物种赤芝 Ganoderma lucidum）的子实体在五个不同发育阶段的材料为
灵芝是一类具有多种药用功效的药用真菌，其中三萜类化合物是其主要药理活性物质之一。本研究以两个灵芝物种（新发现物种白肉灵芝 Ganoderma leucocontextum与传统药用物种赤芝 Ganoderma lucidum）的子实体在五个不同发育阶段的材料为研究对象，开展联合转录组与代谢组分析。研究人员通过超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）的代谢组学分析共鉴定到514种差异代谢物（筛选标准为变量重要性投影值 VIP ≥ 1 且 P< 0.05），其中三萜类化合物是两物种间差异最显著的代谢物类别：白肉灵芝在整个发育过程中持续含有更高水平的 ganoleucoin，而赤芝则维持较高水平的 ganoderic acid。转录组分析共获得227.61 Gb 清洁数据（Q30碱基百分比 > 93%），在五个发育阶段中共鉴定到228,593个显著差异表达基因（DEGs）。三萜合成途径中的大多数基因（包括多个灵芝特有的细胞色素 P450（CYP450）家族基因）在赤芝中表达水平更高。研究人员选取6个关键差异表达基因进行实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）验证，结果显示其表达趋势与转录组数据一致。此外，研究还鉴定出6个可能参与灵芝三萜代谢的潜在转录因子（属于热休克转录因子（HSF）和 GNAT 家族）。本研究结果为两种灵芝物种发育过程中的动态基因表达与差异代谢物提供了数据集，为后续深入研究奠定了基础。
研究背景
灵芝（Ganoderma）隶属于真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科，其子实体因质地厚且软木化而不被归类为食用菌，但因其富含三萜类、多糖、核苷类和生物碱类等活性成分而被广泛研究为药用真菌。在传统中医中，灵芝被认为具有补气安神、止咳平喘的功效。赤芝（Ganoderma lucidum）已被证实具有抗肿瘤、降压、抗病毒及免疫调节等多种作用，这些疗效主要归因于其三萜类化合物的多样生物活性，包括抗肿瘤、保肝解毒、抗 HIV 及降胆固醇等。国际真菌名称数据库 Species Fungorum 收录了421个被接受的灵芝属物种，但并非所有物种均具药用价值。中国药典将赤芝和紫芝的子实体列为法定中药材。白肉灵芝（Ganoderma leucocontextum）是2015年在中国西藏林芝发现的新物种，近年从其分离出的新型三萜类化合物显示出免疫调节等药理活性，提示其可能含有传统赤芝不具备的特殊三萜和多糖成分。然而，由于研究时间有限，白肉灵芝关键发育阶段的基因及代谢通路仍不明确。鉴于担子菌蘑菇正向遗传学解析有利性状耗时费力，利用组学技术进行综合研究成为可行方案。本研究旨在通过联合转录组和代谢组分析，初步阐明白肉灵芝相较于传统赤芝在活性成分及相关关键基因上的差异，重点关注药理活性三萜类化合物，如灵芝酸（GAs）和 ganoleuconin 及其对应基因。
关键技术方法
研究人员选取西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所提供的白肉灵芝与赤芝菌种，在高粱培养基上培养后，采集五个关键发育阶段（S1：萌芽期；S2：菌盖分化期；S3：膨大期；S4：成熟期；S5：孢子释放期）的子实体样本。采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）进行代谢组学分析，结合转录组测序（RNA-seq）技术获取基因表达谱。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）挖掘与发育阶段相关的基因模块，并利用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）对关键差异表达基因进行验证。
研究结果
Metabolite profiles during the development of G. leucocontextumand G. lucidum（白肉灵芝与赤芝发育过程中的代谢物谱）
研究人员通过 UPLC-MS/MS 定性定量分析两物种五个发育阶段的代谢物，主成分分析显示孢子释放期（S5）与前四个阶段分离明显。共鉴定出514种差异代谢物，主要类别包括萜类、生物碱、酚酸、黄酮、木质素与香豆素、醌类、单宁和甾醇。三萜类是两物种间丰度差异最显著的代谢物，其中白肉灵芝的 ganoleucoin 水平持续高于赤芝，而几乎所有灵芝酸水平均低于赤芝。趋势分析显示189种差异三萜代谢物分布于10个表达谱中，profile 1 在白肉灵芝中呈先下降后快速上升的趋势，profile 9 包含大部分 ganoleuconin。S5 阶段差异三萜占差异代谢物总量的50.7%，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示“二萜生物合成”、“代谢”和“次级代谢产物生物合成”为显著富集通路。
Differential gene expression profiles（差异基因表达谱）
转录组分析共获得227.61 Gb 清洁数据（Q30> 93%），五个比较组合共鉴定到228,593个显著差异表达基因，各阶段数量波动较小。KEGG 分析显示缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成为共同富集通路，硫 relay 系统和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成在四个时期富集。S5 阶段还富集了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路及黄酮生物合成通路。加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出与白肉灵芝 S5 阶段高度相关的棕色模块，包含1400个基因。在三萜生物合成途径中，白肉灵芝的 HMGS和 HMGR基因表达高于赤芝，而下游基因 MVD、FPS、SQS和 LS在赤芝中表达更高，这与代谢组数据一致。灵芝特有的 CYP5359 家族基因中，除 CYP5359X2、CYP5359E2和 CYP5359V2外，多数在赤芝中表达更高，且多在 S1 和 S5 阶段达到峰值。
Transcription factors（转录因子）
研究人员从转录组数据中鉴定出2786个转录因子基因，分属50个家族，其中 C2H2、zn-clus、TRAF、GNAT、C3H、HMG、SET、SNF2 和 HB-other 九个家族占总数的75.7%。从中筛选出6个可能参与三萜类物质生物合成的转录因子（属于 HSF 和 GNAT 家族）。RT-qPCR 验证了六个关键差异表达基因的表达趋势与转录组数据一致。
讨论与结论
植物次级代谢产物在食品和制药工业中具有重要用途，灵芝中已分离出400多种次级代谢产物，主要为羊毛甾烷型三萜（灵芝酸和灵芝烯酸）、混源萜类和甾体及其衍生物。本研究发现赤芝中大多数灵芝酸含量持续高于白肉灵芝，这与传统药用真菌的特性相符。灵芝三萜类通过甲羟戊酸（MVA）途径合成，本研究显示在三萜生物合成早期（从乙酰辅酶 A 到乙酰乙酰辅酶 A 和甲羟戊酸），两物种基因表达无显著差异，但从甲羟戊酸-5-二磷酸到异戊烯基焦磷酸直至羊毛甾醇（大多数灵芝酸的前体）的合成过程中，赤芝关键基因表达显著高于白肉灵芝，这与代谢组数据一致。细胞色素 P450 单加氧酶（CYP450s）在催化羊毛甾醇转化为灵芝酸中起关键作用，本研究中 CYP5359 家族在赤芝的高表达与其较高的灵芝酸含量相符。转录因子在调控基因表达中发挥核心作用，本研究鉴定的 HSF 和 GNAT 家族转录因子可能通过热应激、Ca2+和活性氧（ROS）信号通路影响灵芝三萜含量。该研究为解析两种灵芝的发育动态及三萜代谢调控提供了重要的组学数据集，发表于《Microbiology Spectrum》。
