《Beverage Plant Research》：A metabolic optimization strategy based on modular genomic integration of the MVA pathway to enhance lycopene production in Escherichia coli
编辑推荐：
番茄红素是一种具有生物活性的四萜类抗氧化剂，广泛应用于食品、制药和化妆品领域，但其生产仍受限于植物提取率低和化学合成成本高等问题；当前，微生物工程为其提供了一种经济高效的替代方案。本研究采用基于CRISPR-Cpf1的系统，将甲基赤藓糖醇磷酸途径（MEP，me
番茄红素是一种具有生物活性的四萜类抗氧化剂，广泛应用于食品、制药和化妆品领域，但其生产仍受限于植物提取率低和化学合成成本高等问题；当前，微生物工程为其提供了一种经济高效的替代方案。本研究采用基于CRISPR-Cpf1的系统，将甲基赤藓糖醇磷酸途径（MEP，methylerythritol phosphate pathway）中的关键基因dxs、idi和ispDF整合至底盘菌株大肠杆菌MG1655基因组中，构建了MEP途径过表达菌株。此外，通过引入T7 RNA聚合酶以及来源于不同物种的mvaE和mvaS，对甲羟戊酸途径（MVA，mevalonate pathway）下游模块（MBot）进行了优化，相关基因来源包括酿酒酵母、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌。MEP基因整合使番茄红素产量较初始菌株提高2 mg/L。值得注意的是，不同来源的下游MBot模块表现出显著差异的发酵性能。最优组合为来源于酿酒酵母的erg12、来源于肺炎链球菌的mvaK和mvd1，以及来源于大肠杆菌的idi；该组合在摇瓶培养中实现了86 mg/L的番茄红素滴度，较亲本菌株提高21倍。与此相反，为消除内源MEP通量而进行的dxr缺失导致番茄红素滴度下降7倍，而MEP过表达未能进一步提升产量，这表明决定类胡萝卜素高效生物合成的关键因素并非单纯前体供给，而是MEP-MVA两条途径之间的协同作用。
该论文发表于《Beverage Plant Research》，研究围绕番茄红素在大肠杆菌中的稳定高效生物合成展开，核心目标是通过模块化基因组整合替代传统质粒表达系统，系统优化甲羟戊酸途径（MVA，mevalonate pathway）与内源甲基赤藓糖醇磷酸途径（MEP，methylerythritol phosphate pathway）之间的协同关系，从而提高番茄红素产量并改善工程菌株的遗传稳定性。番茄红素属于类胡萝卜素家族中的四萜化合物，因其较强抗氧化活性及在食品、医药、化妆品等领域的重要应用价值而受到持续关注。现有工业获取方式主要包括植物提取、化学合成及微生物发酵。前两者分别受到提取效率低、纯化复杂以及化学残留、热氧降解等问题制约，因此借助代谢工程和合成生物学手段构建微生物细胞工厂，成为更具可持续性和经济性的技术路线。
从宿主选择看，大肠杆菌因遗传背景清晰、生长快速、易于操作而成为异源萜类化合物生物合成的重要底盘。番茄红素合成依赖异戊烯基焦磷酸（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）两类通用前体，这些前体可由内源MEP途径生成，也可通过外源导入的MVA途径供给。尽管增加前体供给通常被视为提高萜类产量的关键策略，但如何在宿主代谢网络中实现两条途径的有效耦联、降低代谢负担并兼顾菌株稳定性，仍是该领域面临的主要问题。传统多基因质粒表达虽然便于构建，却常伴随抗生素依赖、拷贝数波动、表达泄漏和宿主代谢负担增加等缺陷，因此开展基于染色体整合的模块化优化研究具有明确必要性。
研究人员首先构建番茄红素基础合成模块，将来源于Pantoea ananatis的crtB、crtI、crtE导入大肠杆菌MG1655，并比较不同表达载体的性能。结果显示，携带pGex-crtBIE的菌株番茄红素产量高于pTrc99a-crtBIE，因而被选为后续工程改造的初始合成模块。在此基础上，研究人员从强化内源MEP途径入手，采用染色体整合和质粒过表达两种方式增强dxs、idi、ispDF表达。结果表明，染色体整合构建的AME菌株提升效果最佳，番茄红素较初始菌株增加约2 mg/L，而单纯质粒过表达作用有限。这提示MEP通量增强虽然有效，但提升幅度较小，单靠内源途径难以充分突破前体供给瓶颈。
为进一步提升前体通量，研究引入异源MVA途径并进行模块化拆分优化。上游模块MUp由mvaE和mvaS组成，用于将乙酰辅酶A转化为甲羟戊酸；下游模块MBot负责进一步生成IPP和DMAPP。研究人员首先在araB位点整合T7 RNA聚合酶，建立L-阿拉伯糖诱导型T7表达系统，以减少异源通路中毒性中间产物带来的代谢压力；随后在lpxM位点整合MUp模块，构建MGT7E底盘。针对MBot模块，则分别测试来源于酿酒酵母、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的不同组合。质粒水平测试发现，只有来源于肺炎链球菌的SpMBot能够维持正常生长并支持番茄红素生成，说明不同物种来源的MVA下游酶在大肠杆菌中的相容性差异显著。
在此基础上，研究人员进一步采用染色体整合替代质粒表达，将不同来源的MBot模块整合到ldhA位点。一方面，ldhA失活有利于削弱竞争代谢支路；另一方面，该位点被验证为有利于外源模块表达的有效整合位点。结果表明，整合SpMBot的菌株MGT7EKSp产量达到36 mg/L，明显优于其他单一来源模块。更重要的是，研究并未停留于单模块筛选，而是开展了跨来源组合优化。通过将酿酒酵母来源erg12与肺炎链球菌来源下游酶进行重组，构建出MGT7EKScSp菌株，其番茄红素滴度达到86 mg/L，为亲本菌株的21倍。这一结果表明，MVA下游模块内部不同酶的最优来源并不一定来自同一物种，跨物种模块重组能够显著改善通路整体匹配性和代谢通量分配。
作者为开展研究主要采用了以下关键技术方法：以大肠杆菌MG1655为底盘菌株，利用CRISPR/Cpf1双质粒基因编辑系统进行araB、lpxM、ldhA、araA等位点的模块化染色体整合与dxr缺失操作；构建crtBIE、MUp和多来源MBot表达模块并进行组合优化；通过摇瓶发酵、丙酮提取及474 nm分光光度法定量番茄红素；结合生长曲线、胞内ATP检测与Alamar Blue氧化还原状态分析，评估不同代谢工程策略对菌株生理与能量代谢的影响。样本来源主要为实验构建的大肠杆菌工程菌株，以及来自不同供体物种的功能基因。
以下对论文结果部分按原文小标题进行解读。
构建初始番茄红素生产菌株并通过增强MEP途径改进产量
研究人员首先构建两种番茄红素表达模块，并通过摇瓶发酵比较其产量差异，证明pGex-crtBIE更适合在MG1655中驱动番茄红素生物合成。随后，通过基因组整合或质粒表达增强dxs、idi和ispDF，评估内源MEP途径强化效果。实验结果说明，MEP途径增强可提高番茄红素产量，但基因组整合优于质粒过表达，且总体提升有限，提示仍需引入外源MVA途径作为额外前体供给来源。
不同来源MVA下游模块的比较
研究人员构建了带有T7 RNA聚合酶的诱导型表达底盘MGT7，并在lpxM位点整合MUp生成MGT7E，以便测试不同来源MBot模块。结果显示，ScMBot和SaMBot在质粒表达时导致生长受抑且几乎不产番茄红素，而SpMBot表现出更好的宿主兼容性。进一步比较不同启动子后发现，T7启动子驱动SpMBot具有较优表现，说明该诱导系统具备良好的表达控制能力，并适合后续整合优化。
MVA组合途径优化
研究人员将不同来源MBot模块整合至ldhA位点，发现单独整合SpMBot的菌株产量最高，达到36 mg/L。随后采用交叉组合和并联组合两类策略探索不同模块间的相互作用。结果表明，含有酿酒酵母erg12和肺炎链球菌其余下游酶的MGT7EKScSp菌株表现最佳，番茄红素产量升至86 mg/L。该结果说明erg12在MVA通量优化中具有关键作用，同时也说明模块组合的有效性取决于酶学匹配，而非简单堆叠更多基因。
不同来源idi的比较研究以平衡异戊二烯前体
由于IPP与DMAPP平衡直接影响萜类产物合成效率，研究人员将MGT7EKScSp中的idi替换为多个物种同源基因，比较其对番茄红素产量的影响。结果显示，保留大肠杆菌自身idi时产量最高，其他来源同源酶均导致产量下降。这表明在该工程体系中，前体异构平衡高度依赖宿主本源酶与异源MVA模块之间的适配性。
MUp增强与MBot模块平衡
研究人员在高产菌株背景中进一步增加MUp拷贝，以增强上游甲羟戊酸供给。结果显示，该策略对不同MBot背景的作用并不一致：MGT7EEKSc产量提升至43 mg/L，而MGT7EEKSp产量反而下降，MGT7EEKScSp则变化不显著。由此可见，上游前体供给增加并不必然转化为产物提升，其效果取决于下游模块是否具备足够及时、稳定的转化能力。进一步对erg12-idi模块和erg8-erg19模块进行强化后，MGT7EEKScSp产量仍无显著改善，说明这些单元并非该菌株的主要限制因素。
dxr的缺失与功能验证
论文最后系统分析了MEP与MVA两条途径之间的关系。研究人员在不同MBot整合菌株中尝试缺失dxr，并结合MEP过表达进行对照分析。结果显示，SaMBot背景下无法获得dxr缺失株，提示其通量不足以支撑细胞生长。对成功构建的缺失株而言，dxr缺失均显著抑制生长，并明显降低番茄红素产量，其中MGT7EKScSpdm由86 mg/L降至10 mg/L。与之相对，MEP过表达并未显著提高番茄红素积累。进一步的ATP和胞内还原力检测表明，dxr缺失会显著降低细胞能量状态和NAD(P)H水平，而MEP增强对这些指标影响较小。由此可见，MEP途径在该体系中的核心作用并不只是增加异戊二烯前体，而是维持细胞基础代谢平衡、氧化还原稳态和能量稳态。
从讨论部分看，本文最重要的学术贡献在于揭示了番茄红素高效合成并非单纯依赖“更多前体”，而依赖MEP与MVA两条途径之间的功能协同。研究证明，单拷贝染色体整合的模块化MVA系统即可获得与多拷贝整合相当的产量，同时避免质粒依赖和基因组不稳定问题，具有更高工业应用潜力。研究还指出，不同来源MVA酶的宿主适配性差异显著，最优组合需要在模块层面而非单基因层面进行重构。此外，dxr缺失实验进一步说明，即使引入完整异源MVA途径，内源MEP途径仍不可替代，尤其在维持细胞生长、能量供应和抗逆稳态方面具有基础性作用。
研究结论部分可译为：本研究筛选并优化了来源于不同生物的MVA途径关键酶，将其组装为单一操纵子，并以单拷贝形式整合至染色体中，从而构建出一种无需抗生素、无重复序列、能够稳定且高效生产番茄红素的大肠杆菌底盘。摇瓶发酵结果表明，该单拷贝整合菌株的番茄红素滴度可达到既往多拷贝基因组整合菌株的报道水平，同时其生长状态与亲本对照株相当，从而规避了质粒依赖和基因组不稳定的传统缺陷。为阐明MVA与MEP途径之间的相互关系，研究人员进一步在完整MVA背景下构建了dxr缺失株和MEP过表达株。结果表明，MEP过表达并未提升番茄红素滴度，而dxr缺失则严重损害细胞生长并显著降低产量，表明MEP途径对于维持基础代谢平衡和能量稳态不可替代。综上，本研究为大肠杆菌中番茄红素合成提供了更稳定的工程策略，并成功构建了dxr基因缺失但仍可正常生长的大肠杆菌菌株，为后续MEP途径机制解析提供了明确的遗传背景。
