《Biotechnology Reports》：AAV-mediated delivery of CRISPR/Cas9 targeting conserved overlapping ORFs efficiently suppresses HBV replication in hepatocyte models
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慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染因共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的持续存在仍是全球重大健康负担，现有抗病毒疗法对其作用有限。研究人员开发了由腺相关病毒（ad
慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染因共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的持续存在仍是全球重大健康负担，现有抗病毒疗法对其作用有限。研究人员开发了由腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）递送的CRISPR/Cas9系统，靶向HBV基因组保守区域。研究设计了三种向导RNA（guide RNA, gRNA）靶向表面抗原与前基因组聚合酶基因的重叠开放阅读框，并以逆转录酶靶向gRNA及替诺福韦阿拉芬胺（tenofovir alafenamide, TAF）为对照，在HepG2.2.15细胞及可诱导HBV感染的人肝样细胞（differentiated immortalized hepatocyte?like cells, d?imHCs）中进行评估。结果显示，所有gRNA均显著降低细胞内与细胞外HBV DNA水平，并中度降低乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）分泌。其中，gRNA2可诱导移码突变，抗病毒效果最优，显著减少cccDNA、病毒DNA、病毒RNA、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen, HBcAg）及HBsAg分泌，且抑制作用可持续至第12天。上述发现表明，AAV介导的CRISPR/Cas9系统是治疗慢性HBV感染的一种有前景的基因治疗策略。
本研究针对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染难以根治的核心难题——共价闭合环状DNA（cccDNA）在肝细胞内的长期稳定存在，提出了基于腺相关病毒（AAV）递送CRISPR/Cas9系统的靶向治疗策略。当前临床一线药物聚乙二醇干扰素α（Peg?IFN）与核苷（酸）类似物逆转录酶抑制剂（NUCs）虽能抑制病毒复制，但无法清除cccDNA，导致停药后易复发，因此开发能够靶向并破坏cccDNA的新型治疗手段具有重要临床意义。研究人员选择HBV基因组中表面抗原与前基因组聚合酶基因的重叠开放阅读框作为靶点，设计三种向导RNA（gRNA），并利用AAV双载体系统克服CRISPR/Cas9元件包装容量限制，分别在稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞系与自然感染模型d?imHCs中评估其抗病毒效果。结果表明，该系统可有效降低cccDNA及各类病毒核酸和蛋白质水平，其中gRNA2因诱导移码突变而表现出最显著的持续抑制效应，优于传统药物替诺福韦阿拉芬胺（TAF）。该研究发表于《Biotechnology Reports》，为慢性乙型肝炎的功能性治愈提供了新的基因治疗思路。
在技术方法上，研究人员首先基于多基因型HBV全基因组比对筛选保守序列并设计gRNA，通过生物信息学工具预测切割效率与脱靶风险；采用AAV双载体系统分别携带Cas9片段与gRNA，在HEK293T细胞中包装病毒颗粒；利用HepG2.2.15细胞系与HBV自然感染的d?imHCs模型进行体外实验；通过定量PCR（qPCR）、液滴数字PCR（ddPCR）、免疫荧光及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测cccDNA、病毒核酸、HBsAg及HBcAg水平变化；并结合T7核酸内切酶I（T7E1）错配切割实验与Sanger测序验证编辑效果。
研究结果分为五个部分。第一部分为gRNA设计，研究人员基于HBV基因型D亚型ayw的全基因组序列，比对A?J基因型，选取表面抗原与聚合酶基因重叠区的保守序列，设计出gRNA1?3，并通过CRISPOR等工具验证其特异性与高效性，确保对人基因组无显著脱靶风险。第二部分在HepG2.2.15细胞中评估抗病毒效果，结果显示gRNA2在第3天即可显著降低细胞内HBV DNA，并在整个观察期内持续抑制细胞内与细胞外病毒DNA及HBsAg分泌，效果与逆转录酶靶向gRNA相当。第三部分通过DNA测序与蛋白结构预测分析编辑后果，发现gRNA2可在靶位点引起4核苷酸缺失并导致移码突变，预测的HBsAg与聚合酶蛋白结构发生显著改变，丧失DNA与蛋白质结合功能。第四部分在d?imHCs自然感染模型中验证疗效，gRNA2可将cccDNA水平降低约60%，显著抑制细胞内HBV DNA、总RNA、前基因组RNA（pgRNA）及preS1 RNA，并持续降低病毒载量与HBsAg分泌，免疫荧光显示HBcAg表达几乎消失，且未检测到明显细胞毒性。第五部分通过T7E1实验证实gRNA2在HBV基因组中产生特异性插入缺失突变，进一步验证其靶向活性。
在讨论部分，研究人员指出，靶向重叠开放阅读框的策略可同时破坏多个病毒基因功能，提高抗病毒效果；AAV递送系统在肝细胞模型中安全性良好，未引起形态或凋亡相关毒性；相较于传统药物TAF，gRNA2不仅能抑制病毒复制，还能有效降低cccDNA水平，但在完全清除cccDNA方面仍有局限。结论部分强调，AAV介导的CRISPR/Cas9靶向保守重叠开放阅读框是一种可行的HBV治疗策略，gRNA2通过干扰病毒复制与转录途径实现持续抑制，值得进一步推进至体内研究与临床转化。
