《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Development of an Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography–Triple Quadrupole Mass Spectrometry Method for Multiclass Phytohormone Quantification Via Multifunctional Chemical Derivatization
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植物生长调控及对外界生物与非生物胁迫的响应由植物激素介导。深入理解植物代谢组效应对于应对未来全球农业与食品领域的挑战至关重要。为此，研究人员开发了一种液相色谱-质谱联用方法，以提升对不同类别植物激素浓度的测定能力。仅需20 mg植物材料，即可在一次10分钟的分
植物生长调控及对外界生物与非生物胁迫的响应由植物激素介导。深入理解植物代谢组效应对于应对未来全球农业与食品领域的挑战至关重要。为此，研究人员开发了一种液相色谱-质谱联用方法，以提升对不同类别植物激素浓度的测定能力。仅需20 mg植物材料，即可在一次10分钟的分析中，利用稳定同位素稀释法测定包括18种赤霉素（gibberellins, GAs）、脱落酸（abscisic acid, ABA）、水杨酸（salicylic acid, SA）、生长素（auxin）和茉莉酸类（jasmonates）在内的共27种激素。通过碳二亚胺-肼一锅多功能化学衍生策略，检测限可达0.04~29.9 nM。该方法在番茄、玉米和独行菜样品中的应用验证了其适用性，实现了多类植物激素的定量分析。
研究背景方面，植物激素参与调控植物生长发育及应对环境胁迫的过程，其浓度变化直接影响生理效应。然而，植物激素内源含量低、种类多样且化学性质差异大，传统分析方法常需大量样品、复杂前处理且仅能覆盖少数丰度较高的目标物，难以满足高通量、全面定量的需求。尤其是赤霉素类在质谱中离子化效率低，限制了其在多类激素同步分析中的应用。因此，研究人员针对这一瓶颈，结合多功能化学衍生技术与超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）平台，旨在实现小样品量下的多类植物激素快速、灵敏定量，以支持植物抗逆研究与分子育种。
关键技术方法上，研究人员采用番茄（Solanum lycopersicum 品种M82）、玉米（V3发育阶段叶片）及独行菜（Lepidium sativum）作为样本队列来源，利用多功能化学衍生策略，将碳二亚胺试剂（N-(3-(二甲氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐，EDC）与肼类试剂（Girard’s reagent T, GT）在一锅内完成对赤霉素与非赤霉素类激素的同步衍生。样品经甲醇-水-甲酸提取、液液萃取富集后，使用UHPLC-MS/MS在正离子模式下进行分离与检测，结合稳定同位素稀释法（stable isotope dilution assay, SIDA）建立校准曲线，并进行方法学验证。
结果与讨论部分如下：
多功能化学衍生策略
研究人员筛选多种碳二亚胺试剂，最终选择EDC用于赤霉素衍生，并结合GT对含羰基的非赤霉素类激素进行衍生。两者在同一反应体系中互不干扰，EDC提高赤霉素的离子化效率，GT引入带正电的三甲铵基团增强非赤霉素类的质谱响应，从而实现一锅衍生。
衍生反应条件优化
通过对温度（10~60℃）与时间（40~420分钟）的系统优化，确定最佳反应条件为25℃下反应180分钟。该条件下单羧酸型赤霉素在较短时间内完成衍生，而含二、三羧酸的赤霉素则需要更长时间达到稳定衍生效率。
方法开发与验证
研究人员在叶绿素基质和真实植物样本中验证了方法的准确度与精密度。大多数激素回收率在80%~120%之间，部分含多羧基的赤霉素略低但仍可定量。检测限（LOD）范围为0.01~8.96 nM，定量限（LOQ）为0.04~29.9 nM，均处于生理相关浓度范围内。基质效应影响较小（70.5%~115.9%），日内与日间精密度符合分析要求。
不同植物样品中的植物激素定量
应用该方法于番茄叶片、玉米叶片及独行菜各组织，成功定量27种激素。结果显示，不同物种及组织间激素分布存在显著差异。例如，玉米叶片中GA53浓度最高，达96.5 ng/g；独行菜茎中GA8浓度最高（110 ng/g）；番茄叶片中水杨酸浓度超过1000 ng/g。储存时间对番茄种子中活性赤霉素含量有显著影响，短期储存含量较高，长期储存下降，反映了种子休眠状态的变化。
讨论与结论
本研究开发的SIDA-UHPLC-MS/MS方法，结合多功能化学衍生，实现了小样本量（20 mg）下多类植物激素的快速、灵敏、同步定量。该方法在10分钟内完成分析，覆盖18种赤霉素及9种其他激素，检测限与已有报道相当甚至更优，适用于大规模育种与植物胁迫研究。研究结果表明，该方法可为植物激素动态调控机制解析、作物抗逆性评估及育种优化提供可靠的技术支持，具有重要的农业与食品科学应用价值。论文发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。
