综述：增强实体瘤中 CAR-T 细胞安全性、持久性和疗效的先进策略

《Frontiers in Immunology》：Advanced strategies to enhance the safety, persistence, and efficacy of CAR-T cells in solid tumors

　　

嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法彻底改变了血液系统癌症的治疗，但面临着严峻挑战，包括严重的治疗相关毒性、高度抑制性的肿瘤微环境（TME）、长期持久性有限以及在实体瘤中的归巢/浸润能力差。本综述概述了旨在解决这些问题并提高 CAR-T 细胞疗法的安全性、持久性和疗效的最新基因工程策略。为了减少细胞因子释放综合征和神经毒性，研究人员开发了亲和力调节和人源化单链可变片段（scFvs）、铰链/跨膜区（TM）优化以及免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）校准等方法，并开发了包含自杀基因、抗体桥接开关以及光遗传学或缺氧门控电路的可编程“关闭”和“开启”系统。TME 重塑策略利用纳米材料进行靶向细胞因子递送、细胞表面“背包”系统以及释放细胞因子或检查点阻断剂的工程化溶瘤病毒。为了提高持久性和抗耗竭能力，研究人员采用了包括基于 CRISPR 的编辑和多重短发夹 RNA（shRNA）平台在内的精确基因组工程技术，以靶向抑制性受体和驱动耗竭的转录程序。此外，趋化因子受体工程和基于局部生物材料的递送系统也被讨论作为增强 CAR-T 细胞归巢和瘤内持久性的方法。这些创新共同指向了集成化的、患者特异性的 CAR-T 平台，该平台结合了安全控制、代谢和转录灵活性以及通过 TME 增强的归巢能力，从而拓宽其临床应用范围。

嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法代表了免疫治疗的突破性进展，为某些血液系统恶性肿瘤提供了一种高度个性化的治疗方法。CAR-T 细胞是经过基因工程改造的 T 淋巴细胞，旨在识别并清除靶癌细胞。这是通过修饰患者的自体 T 细胞以表达称为 CAR 的合成受体来实现的，这些受体靶向特定的肿瘤相关抗原（TAA）。与内源性 T 细胞受体不同，CAR 独立于主要组织相容性复合体（MHC）提呈来识别抗原，从而能够直接且强效地对抗恶性细胞。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的多种 CAR-T 细胞产品的临床成功证实了这一策略，这些产品在复发性或难治性癌症（包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤）患者中显示出显著的缓解率。

CAR 分子由几个整合结构域组成，共同使 T 细胞能够识别并消除肿瘤细胞。在细胞外水平，源自抗体的单链可变片段（scFv）通过直接结合 TAA 赋予抗原特异性。该抗原结合结构域连接到铰链或间隔区，提供结构灵活性和最佳的靶点接触空间取向。跨膜结构域将 CAR 锚定在 T 细胞膜上并有助于受体稳定性。在细胞内，CAR 包含一个信号传导结构域（ICD），通常源自 CD3ζ，而在更先进的设计中，还包含一个或多个共刺激结构域，以增强 T 细胞活化、增殖和存活。CAR 架构的模块化特性使得系统优化成为可能，推动了具有逐步增强功能的连续几代 CAR 的演变。第一代 CAR 最为基本，仅由 CD3ζ信号结构域组成，导致 T 细胞增殖差、持久性有限且临床反应弱。第二代 CAR 通过引入单个共刺激结构域（通常为 CD28 或 4-1BB/CD137）解决了这些限制，显著改善了 CAR-T 细胞的扩增、细胞因子分泌和体内存活。第三代 CAR 进一步整合了两个共刺激结构域以放大细胞内信号传导，但临床试验结果不一。第四代 CAR（也称为 TRUCKs）引入了编码促炎细胞因子（如白细胞介素 -12，IL-12）的基因，主动重塑肿瘤微环境（TME）。第五代 CAR 则整合了细胞因子受体信号结构域，以更紧密地模拟生理性 T 细胞激活途径。尽管取得了这些进展，但 CAR-T 细胞疗法的广泛应用，特别是在实体瘤中，仍受到严重治疗相关毒性、低效的归巢和浸润、TME 的强免疫抑制性以及输注细胞长期持久性不足等关键挑战的限制。

在增强 CAR-T 安全性的工程策略方面，研究人员致力于减轻毒性同时保持治疗潜力。细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）是主要的并发症。为了缓解这些风险，研究人员开发了自我调节的 CAR 设计。一种策略是微调 CAR 对 TAA 的结合亲和力，通过降低亲和力使 CAR-T 细胞优先靶向高抗原表达的肿瘤细胞，同时 sparing 低抗原水平的健康组织。例如，具有降低抗原结合亲和力的 CD19 靶向 CAR（CAT）在儿科 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中显示出增强的抗肿瘤活性和改善的安全性。人源化 CAR 构建体是另一种方法，用人类对应物替代鼠源性 scFv 区域，以减少免疫原性并增强持久性。此外，铰链和跨膜结构域（HD/TMD）的优化也被证明能调节激活阈值和毒性，例如含有 CD8α HD/TMD 的人源化 scFv 与降低的 ICANS 发生率相关。在细胞内信号传导方面，包含 4-1BB 共刺激结构域的 CAR 通常比基于 CD28 的 CAR 诱导更受控和持续的激活，这可能归因于 THEMIS-SHP1 复合物减少了 CD3ζ磷酸化并限制了过度的细胞因子分泌。减少 CD3ζ结构域内免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的数量也被假设能限制 CAR-T 细胞的过度激活。

为了提供额外的安全层，研究人员开发了“关闭”CAR 系统，允许通过内部或外部触发器有条件地终止 CAR-T 细胞活性。诱导型半胱天冬酶 -9（iCasp9）自杀基因系统是目前临床上最先进的例子，它可以通过小分子二聚体快速激活，诱导工程化 CAR-T 细胞同步凋亡。另一种自杀开关是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）系统，它将前药更昔洛韦（GCV）转化为有毒的核苷酸类似物，从而选择性消除分裂中的 CAR-T 细胞，但其免疫原性和较慢的杀伤速度是主要局限。抗体介导的“关闭”策略利用西妥昔单抗或利妥昔单抗等药物，通过识别 CAR-T 细胞上共表达的表面安全标记（如截短的 EGFR 或 CD20）来清除细胞。此外，为了在保留抗肿瘤效力的同时提高安全性，研究人员还开发了“开启”CAR 系统，将 CAR-T 细胞激活限制在特定的空间、时间或环境线索下。光遗传学方法利用对光敏感的分子模块（如 LOV2 结构域），通过蓝光照射实现可逆的结构域对接，从而精确控制 CAR 信号传导。低氧响应 CAR-T 细胞系统则是利用肿瘤特有的低氧环境，通过低氧诱导因子 1α（HIF1α）与低氧反应元件（HREs）的结合来启动 CAR 转录，从而限制其在正常含氧组织中的激活。

针对实体瘤中免疫抑制和结构复杂的 TME，研究人员正在开发重塑 TME 的策略。纳米材料作为多功能工具，可用于 TME 的预处理、通过压力诱导激活免疫以及作为细胞相关的递送系统。例如，靶向肿瘤的脂质体可共递送磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）抑制剂和免疫激动剂α-半乳糖基神经酰胺（α-GalCer），以选择性清除免疫抑制细胞群。纳米酶（如基于铜的纳米颗粒）可通过光热疗法（PTT）增加活性氧生成，诱导免疫原性细胞死亡（ICD），从而将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。此外，纳米材料还可直接与 CAR-T 细胞结合形成功能性生物杂交体，或通过脂质纳米颗粒（LNPs）提供伪自分泌细胞因子支持，以增强 CAR-T 细胞的持久性。溶瘤病毒（OVs）则是另一种强大的 TME 调节剂，它们通过裂解肿瘤细胞释放 TAA 和损伤相关分子模式（DAMPs）来启动内源性免疫激活，并可作为局部递送载体输送免疫刺激载荷（如细胞因子或检查点抑制剂）。OVs 还能通过降解透明质酸等基质成分来破坏物理屏障，促进免疫细胞浸润。

为了增强 CAR-T 细胞的持久性和效力，基因工程技术发挥了关键作用。基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑可永久性地破坏抑制性受体（如 PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3）的基因，从而阻止抑制性信号传导并恢复 CAR-T 细胞效应功能。多重编辑策略还可同时靶向驱动 T 细胞耗竭的转录因子（如 NR4A 家族成员）或代谢检查点。相比之下，短发夹 RNA（shRNA）技术提供了一种转录后基因沉默机制，可实现对抑制性受体的可调节、分级抑制，避免了完全基因敲除可能带来的潜在风险。shRNA 特别适用于需要精细调节 CAR-T 细胞功能的情况，例如在实体瘤的动态和免疫抑制环境中。然而，多重 shRNA 的递送面临载体滴度降低和 RNAi 机器饱和等技术挑战。

改善 CAR-T 细胞在实体瘤中的归巢和浸润是另一大重点。由于实体瘤中趋化因子信号传导失调，CAR-T 细胞往往难以有效迁移至肿瘤部位。工程化策略包括使 CAR-T 细胞表达能与 TME 中富集的配体（如 CXCL8、CXCL13）结合的趋化因子受体（如 CXCR1/2、CXCR5），从而恢复其趋化反应性并增强瘤内积累。另一种方法是改造 CAR-T 细胞以分泌 CCL19 等趋化因子，不仅促进自身迁移，还能招募内源性免疫细胞。然而，这些策略必须克服趋化因子和抗原异质性的挑战，以避免脱靶炎症或肿瘤逃逸。

最后，靶抗原的生物学特性（密度和异质性）是制约 CAR-T 疗效的根本因素。实体瘤中抗原表达的高度异质性导致了抗原逃逸现象。为了解决这一问题，研究正向逻辑门控和组合靶向策略转变，例如使用"OR"门逻辑识别两种不同抗原的双靶向 CAR，或需要抗原存在及特定环境线索（如低氧）同时存在的"AND"门系统。尽管下一代 CAR-T 工程策略展现了巨大的治疗前景，但其日益增加的生物学复杂性也给制造、可扩展性和成本带来了重大挑战。未来的成功将取决于能否在工程复杂性与制造可行性之间取得平衡，从而将这些复杂的疗法一致且经济实惠地提供给广大患者群体。