线粒体荧光探针综合综述：设计原理、荧光团工程与功能参数传感

《Materials Today Bio》：A Comprehensive Review of Mitochondrial Fluorescent Probes: Design Principles, Fluorophore Engineering, and Functional Parameter Sensing

　　

线粒体是至关重要的细胞器，在细胞能量代谢、信号传导和内稳态中发挥关键作用，其功能障碍与多种人类疾病密切相关。近年来，线粒体靶向荧光探针的快速发展极大拓展了研究人员可视化线粒体结构以及原位监测多种物理化学和生化参数的能力。尽管现有综述主要根据这些探针特定的生理读出指标进行分类，但目前仍缺乏一个统一的视角来整合探针设计策略、荧光团（Fluorophore）工程和目标生理参数。为解决这一空白，研究人员提供了线粒体荧光探针的系统概述，重点关注分子设计原理、荧光团选择、靶向策略以及对关键线粒体生理指标的传感。此外，研究人员批判性讨论了当前的局限性和新出现的挑战，并概述了该领域的未来方向。本综述旨在为线粒体荧光探针的理性设计提供理论见解和实践指导，促进其在生命科学和生物医学研究中的更广泛应用。

线粒体作为细胞内重要的能量代谢和信号转导中心，其结构的复杂性和微环境的独特性（如膜电位、粘度、pH、温度、ATP水平、活性分子种类及离子梯度等）直接关联着细胞活力与健康。线粒体功能障碍是神经退行性疾病、癌症、心血管疾病等多种病理过程的核心环节，因此精确监测线粒体超微结构及上述生理生化参数的动态变化具有重大的科学意义。荧光探针技术凭借其分子结构易设计、灵敏度与特异性高、能够非侵入性、实时及原位监测多样生理参数等优势，已成为线粒体生物学研究中不可或缺的化学生物学工具。目前，该领域虽已有大量研究，但现有综述多局限于按单一生理读出指标（如仅关注活性氧或膜电位探针）进行分类总结，缺乏从探针设计底层逻辑、光物理机制、荧光团骨架选择到靶向策略及多参数传感之间统一整合的系统性梳理，这在一定程度上制约了新型探针的理性设计和跨学科应用。为此，研究人员开展了关于线粒体荧光探针的综合综述研究，系统归纳了基于光物理机制（如PET、ICT、FRET、AIE、ESIPT等）的探针设计策略，总结了包括罗丹明衍生物、硅-罗丹明（SiR）、花菁（Cyanine）染料、BODIPY、萘酰亚胺、香豆素等在内的主流线粒体靶向荧光团的光物理特性与适用性，并详细阐述了针对不同线粒体功能参数（如膜电位、内膜粘度、pH、温度、ATP、活性氧（ROS）、活性硫物种（RSS）、离子等）的代表性探针及其设计要点。研究指出，线粒体探针主要通过利用高度负性的线粒体膜电位（约-150至-180 mV）驱动的能斯特静电相互作用实现靶向，常引入三苯基膦阳离子、吡啶鎓阳离子、花菁阳离子等带正电基团或依靠特定商用线粒体染料（如Rh123、TMRM、MTG等）进行标记；同时明确了不同设计机制的优势与局限，以及未来在提升靶向精度（如脱离膜电位依赖）、增强光稳定性、发展定量动态测量（如比率计量、荧光寿命成像FLIM、超分辨率成像结合）和多参数 multiplexed 成像等方面的挑战与前景。该综述的发表为相关领域研究人员提供了较为完整的理论框架与实践指导，有助于推动高性能线粒体荧光探针的开发和线粒体生命科学的深入研究，论文发表在《Materials Today Bio》。

研究人员主要通过对现有文献的系统性归纳与批判性分析开展研究，用到的关键技术方法包括：基于光物理机制（光诱导电子转移 PET、分子内电荷转移 ICT、F?rster共振能量转移 FRET、聚集诱导发光 AIE、激发态分子内质子转移 ESIPT）的探针分子设计策略总结；常见线粒体靶向荧光团（罗丹明衍生物、硅-罗丹明 SiR、花菁染料、硼-二吡咯亚甲基 BODIPY、萘酰亚胺、香豆素）的筛选原则与光物理性能对比；以及针对线粒体嵴（Cristae）超分辨成像、膜电位（MMP）、内膜粘度、pH、温度、ATP、ROS、RSS、离子（Ca²⁺、K⁺、Zn²⁺等）等多种功能参数的荧光传感探针的结构特点与应用归纳。

研究结果如下：

1. 1.
   探针设计策略（Probe Design Strategies）：研究人员总结了基于PET、ICT、FRET、AIE和ESIPT等主要光物理机制的线粒体荧光探针设计原理。PET机制通过分析物结合调制电子供体-受体间的电子转移实现“关-开”型荧光响应，适用于膜电位、离子及小分子检测；ICT机制利用给体-受体间电荷重分布对环境（如pH、粘度、极性）的敏感性产生光谱偏移，适合微环境变化监测；FRET机制基于供体-受体间距离依赖的能量转移，可实现膜电位和pH的比率计量与超分辨成像；AIE机制利用聚集或限制分子内运动激活荧光，适合长期追踪与粘度成像；ESIPT机制通过激发态质子转移产生双发射或大斯托克斯位移，适合比率成像与低背景检测。
2. 2.
   线粒体成像常用荧光团（Common Fluorophores for Mitochondrial Imaging）：研究人员梳理了多类荧光团在线粒体探针中的应用。罗丹明衍生物（呫吨染料）因强阳离子性、高亮度和光稳定性常作为膜电位监测与通用标记，但存在浓度依赖性聚集等问题；硅-罗丹明（SiR）通过硅取代氧扩展π共轭，发射红移至远红至近红外，适用于长效追踪与超分辨（STED）成像；花菁染料通过可调聚甲川链实现可见至近红外发射，适合长效标记与深组织成像，但易光漂白；BODIPY衍生物具高量子产、窄发射和强光稳定性，适合粘度、ROS及脂质过氧化检测；萘酰亚胺因强ICT效应适合pH、极性及粘度传感；香豆素具紧凑骨架与高生物相容性，适合pH、离子及微环境成像。
3. 3.
   线粒体参数荧光探针进展（Advances in Fluorescent Probes for Mitochondrial Parameters）：
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     线粒体嵴超分辨成像探针：指出嵴形态与能量转化效率紧密相关的，超分辨技术（STED、STORM、SIM等）需探针具备高光稳定性与抗漂移动态定位；举例了通过全氟烷基链加强内膜疏水锚定的SiRPFA，以及通过氯乙酰基与线粒体蛋白共价不可逆结合的HZ Mito Red/Deep Red等策略。
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     线粒体膜电位（MMP）探针：经典强度型探针（如TMRM、Rh123）易受浓度与光漂白干扰，研究人员总结了基于FRET或可逆单分子设计的改进策略（如OR-C8/SiR-BA系统、SiR-PDI-OH），以实现比率或寿命读出的定量检测。
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     线粒体内膜（IMM）粘度探针：粘度影响膜蛋白迁移与酶效率，TICT（扭曲分子内电荷转移）分子转子是主要机制（如DHX-V-C12、NS-V），AIE、ICT等也被整合用于比率或多通道读出。
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     线粒体pH探针：线粒体pH（约7.8-8.0）影响质子动势与代谢，ICT基探针（如INSA、系列供体-受体探针）可实现比率或双色成像，以监测动态变化及细胞器互作（如铁死亡中的线粒体-溶酶体）。
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     线粒体温度探针：线粒体局部温度常高于其他细胞区室，与代谢活跃度相关；研究人员总结了基于温度依赖非辐射速率（如NIR温度计MTN）或FRET比率（如Mito-TEM 2.0）的设计，需注意激发热与热扩散限制。
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     线粒体ATP探针：ATP是能量货币，基于结构响应（如罗丹明螺内酰胺ATP诱导开环的Rh6G?ACFPN、近红外M838）可实现选择性检测，需克服核苷酸竞争与基质递送问题。
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     线粒体ROS探针：ROS（如H₂O₂、O₂^•?）源于电子漏，具信号与损伤双重角色；基于特定氧化反应（如QHCl检测H₂O₂）或ROS响应纳米组装（如MND-IR@RESV）可实现检测与治疗引导。
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     线粒体RSS探针：RSS（如H₂S、多硫化物、蛋白过硫化物）参与氧化还原信号与保护；基于亲核攻击、还原或金属配位等机制（如MC-1/MC-2检测SO₂衍生物、Mito-AE区分SO₃^2-与Cys）可实现物种鉴别与比率检测。
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     线粒体离子探针：Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺等调控膜电位、代谢与信号；基于BAPTA样、冠醚、二皮考基胺等螯合基团与荧光团（如KLCA系列测Ca²⁺、TP-Gal测Fe³⁺）并结合TPP等靶向基团的探针可实现动态监测，需注意选择性、动力学与校准。

在讨论与结论部分，研究人员指出线粒体荧光探针已从简单的定位试剂发展为能够实现定量传感和超分辨成像的多功能平台。目前仍存在的挑战主要包括：依赖膜电位静电吸引的靶向策略可能导致非特异性积聚或膜电位扰动，未来需发展不依赖膜电位的靶向策略（如配体-受体、肽修饰、疏水域插入等）；提升光稳定性、量子产与生物相容性以满足长效活细胞与组织成像；以及从半定量走向绝对定量分析，通过整合FLIM、超分辨技术与机器学习辅助图像分析实现精确量化，并发展多参数同时成像以整体描绘线粒体功能状态。展望未来，新一代探针将融合合成化学、分子生物学与计算模拟，具备可激活/自校准、多模态成像及治疗潜力，同时发展深组织穿透的近红外发射探针以促进在体成像，最终通过高级分子设计、智能成像系统与生物学洞察的汇聚，推动线粒体研究的新时代，实现线粒体相关疾病的精准诊断、实时监测与靶向干预。