综述：基于复合纳米粒子的生物传感技术在检测食源性细菌病原体中的应用：分析设计、设备实现及实际应用验证

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Multiplex nanoparticle-based biosensing for foodborne bacterial pathogens: Analytical design, device translation, and real-world validation

　　Sümeyra Savas | Seyed Mohammad Taghi Gharibzahedi
生物传感器与生物技术实验室（BBL），班迪尔马奥内耶蒂埃卢尔大学医学院，班迪尔马10200，巴勒克埃西尔，土耳其

**摘要**
食源性细菌病原体（FBPs）经常共同存在于乳制品、肉类、家禽、海鲜和新鲜农产品等食品中。因此，需要具备同时检测能力的分析仪器。尽管传统分子和微生物技术准确，但它们依赖于繁琐的程序和集中式检测，而灵敏的生物传感技术则能够实现快速筛查。本综述评估了基于纳米粒子（NP）的生物传感技术在FBP检测方面的最新进展，重点关注从双病原体检测向多重和多模式系统的转变。文章讨论了生物受体工程、荧光、表面增强拉曼散射（SERS）、电化学、光热、核酸、CRISPR以及传感器阵列策略的进步，并评估了将这些策略整合到侧向流动分析、微流控芯片、便携式读数器和智能手机辅助系统中的效果。同时，还对代表性食品基质中的验证数据进行了严格审查。此外，还讨论了监管考虑、制造可扩展性和设备级商业化因素。基于NP的生物传感器通过结合光谱、时间、磁性和分子编码策略，显示出对多种FBPs的高特异性。它们能够在牛奶、肉类、家禽、海鲜和新鲜农产品等食品基质中同时检测FBPs。侧向流动、微流控和便携式读数器格式提高了分析通量，减少了样品消耗，并缩短了符合食品安全标准筛查级别的检测时间。当多模式设计与荧光、SERS、电化学或核酸读数器结合时，检测可靠性显著提高。多功能纳米剂增强了信号强度和稳定性。监管分类、批次间重现性和经济可行性被认为是实际应用的关键决定因素。实施这些技术取决于协调的验证、可扩展的制造以及与监管和市场要求的对接。

**引言**
食源性细菌病原体（FBPs）是全球发病率和经济损失的主要原因。这主要是由于食品供应链日益复杂、全球化以及单一产品中多种微生物污染物的频繁共存所致。因此，需要具备以下三个基本特性的分析工具：（i）灵敏且特异；（ii）能够快速适应多种食品基质；（iii）能够同时识别多种病原体，从而有效进行食品安全监测。基于培养和分子检测的传统微生物方法（如聚合酶链反应（PCR）具有高准确性和监管认可度，但通常受到长时间周转、多步骤工作流程、需要熟练人员以及依赖集中式实验室基础设施的限制[1] [2]。这些限制使得它们不适合高通量监测、现场筛查和快速决策。

生物传感技术将生物检测事件转化为可测量的物理信号，成为传统方法的补充工具。纳米粒子（NPs）的独特物理化学性质（如高表面积与体积比、可调的光学和电学行为以及与多种生物受体的兼容性）使基于NP的生物传感器受到特别关注。这些特性有助于编码技术、灵活的表面功能化和信号放大，而这些是单独使用分子标签难以实现的。因此，基于NP的生物传感器表现出快速检测、更简单的检测流程以及与便携式测试格式的兼容性[3] [4] [5]。除此之外，纳米粒子在生物传感系统中还承担了一系列功能角色，包括信号放大、目标区分的信号编码、目标捕获和富集以及界面工程，以增强选择性结合并减少非特异性相互作用[6] [7] [8]。此外，多功能纳米结构便于在单一平台上整合多种信号输出[7]。这些功能贡献在荧光、表面增强拉曼散射（SERS）、电化学和其他传感策略中得到了广泛体现[6] [8] [9]，表明基于NP的生物传感系统可以通过功能驱动的角度来更有效地理解，而不仅仅是通过其信号转导格式[9]。

鉴于这些功能角色，基于NP的生物传感系统的性能和多样性与其制造工艺和结构设计密切相关。已经探索了多种纳米材料，包括具有光学信号增强特性的金属纳米粒子（如AuNPs、AgNPs和双金属纳米结构）、用于目标富集和分离的磁性纳米粒子（如Fe3O4基系统），以及用于荧光编码的半导体纳米材料（如量子点（QDs）和上转换纳米粒子[10] [11]。碳基纳米材料（如碳纳米管（CNTs）和多巴胺（PDA）涂层结构）以及硅基纳米粒子（如介孔硅）提供了高表面积和灵活的功能化平台[12] [13]，而纳米酶（NZ）和金属有机框架（MOF）衍生的纳米结构引入了催化放大和多功能性[14] [15]。此外，结合光学、磁性和电化学特性的混合和复合纳米结构不断发展，以支持多模式传感和集成检测策略[11] [16]。这些制造驱动的结构和组成变化直接影响纳米粒子的物理化学性质、界面行为，并最终决定基于NP的生物传感系统的分析性能和多重检测能力[11] [17]。

早期的基于NP的生物传感研究主要集中在单一病原体检测上。然而，实际食品污染通常涉及两种或更多病原体。这表明双病原体检测作为向更广泛多重检测过渡的中间步骤具有实际重要性。双检测传感系统证明了在单次实验中同时识别和区分信号的可能性，同时降低了样品消耗[4] [18]。最近的研究转向了多重生物传感（MPB），利用光谱、时间、磁性、空间或化学编码技术同时识别三种或更多目标。

双病原体检测指的是在单一分析工作流程中同时识别两种目标。相比之下，MPB通过信号编码、空间分离或并行识别策略将这一能力扩展到三种或更多目标。多模式生物传感表示在单一平台上整合两种或更多独立的信号转导机制（如荧光、SERS、电化学或光热），提供正交信号生成或交叉验证[16]。因此，多重性涉及目标数量，而多模态性反映了信号转导模式的多样性。这种区别可以理解为一个二维框架，其中生物传感系统根据目标数量（双病原体 vs. 多重）和信号架构（单模式 vs. 多模式）进行分类。

荧光、SERS、电化学、光热、核酸和基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的生物传感技术的发展也提高了多重检测能力。在紧凑的设计中结合了正交识别和检测模式，用于FBPs[1] [19] [20] [21]。得益于侧向流动分析（LFAs）、微流控芯片、便携式读数器和智能手机辅助生物传感器等设备级进步，基于NP的生物传感技术现在更接近于食品安全监测的实际应用[22] [23]。这里的“设备级转化”指的是将基于NP的生物传感策略整合到实用、便携且用户友好的平台上，适用于现场检测，包括系统小型化、操作简便性和与实际食品基质的兼容性考虑。

最近的综述广泛研究了用于食品安全的基于纳米材料的传感技术，重点关注实时监测、智能包装以及用于病原体和毒素检测的多功能纳米材料。例如，Paliwal等人强调了纳米技术与智能传感系统（包括电子鼻、纳米条形码和CRISPR辅助平台）在食品质量、保存和可持续性框架内的整合[24]。然而，这些综述主要讨论了一般传感概念和系统集成，而没有专门分析针对FBPs的多重检测策略、信号编码机制和设备级实现。同样，Mallick等人提供了基于NP的生物传感器在临床、环境和农业领域的综合概述，强调了AuNPs、QDs、MNPs和CNTs等不同纳米材料在提高灵敏度和支持快速现场诊断中的作用[25]。该综述还讨论了新兴趋势，包括集成智能手机的平台、人工智能（AI）辅助的信号处理和基于微流控的芯片实验室系统。不过，这些研究主要关注一般病原体检测策略和材料特性，而没有特别针对FBPs在多重检测、信号编码策略和针对食品安全应用的集成设备级设计。此外，对于在复杂食品基质和实际供应链条件下部署这些系统的实际挑战关注较少。Zhang、Belwal等人专门研究了用于关键食源性病原体的基于纳米材料的生物传感器，主要关注纳米材料特性在改善电化学、比色、荧光、SERS、电化学发光（ECL）、表面等离子体共振（SPR）和动态光散射生物传感器中的作用[8]。他们的综述还指出了重要的转化挑战，包括纳米粒子在复杂食品样品中的稳定性、生物受体亲和力和储存稳定性、检测器小型化以及多重分析。然而，讨论主要是按单独的传感机制和纳米材料辅助的信号改进组织的，而不是从双病原体检测到多重和多模式生物传感系统的开发进展、设备级集成、验证可比性和商业化路径。Jarockyte等人回顾了早期诊断中的多重纳米生物传感器，特别强调了QDs、磁珠–QD检测、流式细胞免疫测定、电化学免疫测定、纸质生物传感器、SERS成像和上转换纳米粒子（UCNPs）[26]。他们的综述提供了关于临床相关生物标志物的光学和纳米材料辅助多重检测策略的重要概述。然而，其范围主要是生物医学和诊断方面的，而不是食品安全方面的，没有具体讨论FBPs的挑战，包括复杂食品基质、食品中的病原体共存、食品样品验证以及转化为现场可部署的食品安全平台。

因此，尽管之前的综述总结了纳米材料类型、传感机制和新兴的集成平台，但仍然缺乏一个将双病原体检测、多重扩展、多模式信号整合和设备级转化联系起来的框架。这一差距还受到持续存在的实际挑战的影响，包括信号串扰、有限的编码能力、标准化不足以及在复杂食品基质中的大规模验证不完整。反复出现的方法学元素（如NP编码、磁分离（MagSep）和LF集成）是MPB策略的基础，并在其分析性能和系统设计中的作用进行了讨论。因此，现有研究尚未将这些限制完全整合到一个从早期双检测系统到先进的多重和可部署生物传感平台的统一进展中。为了解决这个问题，本综述批判性地评估了基于NP的生物传感技术在FBP检测方面的发展，涵盖了从双病原体检测到复杂的多重和多模式生物传感器的结构化路径。它提供了当前能力的全面概述，并概述了实现基于NP的MPB作为下一代食品安全监测工具的新兴方向，重点关注识别策略、信号编码、设备集成、分析验证和转化限制。因此，本综述按以下顺序组织：（i）检测级别的双病原体系统（第2节）；（ii）多重扩展策略和编码架构（第3节；目标级别扩展）；（iii）多模式信号整合和交叉干扰考虑（第4节；信号级别整合和正交验证）；（iv）设备级实现、验证和转化考虑（第5节：用于现场多重病原体生物传感的集成设备和便携式平台；第6节：复杂基质中的实际验证和分析性能；第7节：多重食源性病原体生物传感的局限性和未来方向）。图1展示了NP平台、生物传感模式和应用领域之间关系的统一概念概述。

**图例说明**
- 双病原体纳米粒子基生物传感系统用于检测食品中的食源性病原体
- 双病原体NP基生物传感器旨在解决食品中多种病原体的频繁共污染问题以及单一目标检测的局限性。虽然这些系统被归类为双病原体检测，但一些设计也结合了多种信号转导模式，代表了在有限目标框架内的早期多模式整合形式。这些生物传感器能够在单一检测中同时检测两种微生物，从而减少了分析工作量。
- 多重纳米粒子基生物传感系统用于检测食品中的食源性病原体，扩展了双病原体检测中建立的设计原则，能够在单一分析工作流程中检测三种或更多FBPs。表2总结了代表性的多重实现，显示了随着目标数量增加信号编码策略、识别模式和检测复杂性的变化。
- 与第2节不同，本节关注基于多重模式生物传感，即在一个平台上整合多种信号转导机制。因此，多模态性被视为一个独立的设计维度。
- 基于NP的侧向流动设备因其操作简便、响应迅速和设备要求低，被广泛用作现场环境中多重病原体检测的便携式诊断设备。与第4节不同，该节关注将这些策略整合到为现场应用设计的设备级平台中。近期在设备层面的进展主要集中在整合食品基质覆盖范围和验证模式上。多重纳米粒子（NP）基生物传感器的实际验证主要集中在对食品安全监测具有高度相关性的食品基质上，尤其是牛奶、家禽、新鲜农产品和复合食品。由于牛奶含有较高的蛋白质和脂肪含量，因此成为最常被研究的基质。多重检测系统能够同时检测沙门氏菌属（Salmonella spp.）、大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus），其检测限通常在1–10^2 CFU/mL之间，回收率为90–110%，相对标准偏差也在可接受范围内。

信号串扰和编码能力限制是多重NP生物传感中的一个关键问题，因为每增加一个检测目标都会增加通道重叠、竞争性结合以及信号重叠干扰的可能性。在荧光多重检测中，食品基质的光谱拥挤和背景发射限制了可用通道的数量，因此研究转向了时间分辨荧光（TRF）和近红外（NIR）激发技术，利用超顺磁性纳米粒子（UCNPs）通过信号寿命或激发模式来区分不同信号。

多重NP结构通常在学术实验室中开发；要将其发展为可部署的诊断工具，必须符合管理体外诊断（IVD）设备的法规要求。在食品安全或公共卫生决策应用中，需要正式的诊断设备监管。IVD设备的监管根据风险等级、预期用途和证据要求进行组织。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的分类标准，这些设备被分为I类至III类。

多重NP基诊断技术从实验室验证阶段发展到可现场部署的产品，依赖于可重复的纳米材料合成、稳定的生物功能化以及受控的设备组装。概念验证研究表明这些技术具有较高的分析灵敏度；然而，规模化生产会导致纳米粒子尺寸分布、表面化学性质、结合效率及信号放大行为的变化，从而影响批次间的均匀性。

最近基于设备的多重检测技术表明，其商业化不仅取决于分析灵敏度，还取决于传感化学与便携式硬件的集成、检测步骤的简化以及用户可解读的输出结果。集成在智能手机中的CRISPR/dCas9–SERS平台结合预放大技术能够在大约50分钟内同时检测多种病原体，检测限可低至1 CFU/mL，并且与手持设备兼容。

基于纳米粒子的多重检测方法（MPB）在食品borne病原体检测方面已经成熟，发展成为能够同时在复杂食品基质中实现多重检测的集成式多模式平台。在现有的方法中，基于试纸的荧光检测格式、磁富集辅助检测以及集成式多模式生物传感器代表了短期内最有可能实现商业化的先进解决方案。这些系统结合了良好的分析灵敏度、操作简便性、便携性以及与现有制造工艺的兼容性。

**CRediT作者贡献声明：**
Seyed Mohammad Taghi Gharibzahedi：撰写、审稿与编辑。
SUMEYRA SAVAS：撰写初稿、研究设计与概念化。

**伦理声明：**
本文不包含任何由作者进行的涉及人类参与者的研究。

**利益冲突声明：**
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

**资金支持：**
作者感谢Band?rma Onyedi Eylül大学（土耳其Band?rma）在项目编号BAP-25-1003-007下提供的财政支持。

**利益冲突声明：**
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。