《ACS Synthetic Biology》：Using Domain Insertion to Create Sulfite Reductases That Present Chemical-Dependent Activities
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结构域插入可用于构建活性依赖于分析物结合的氧化还原酶。迄今为止，大多数结构域插入研究靶标的是已知结构的相对较小的氧化还原酶，因此如何将这种蛋白质工程方法应用于需要动态构象变化才能发挥催化作用的大型异源寡聚蛋白仍不清楚。为回答这一问题，研究人员研究了肽段和结构域
结构域插入可用于构建活性依赖于分析物结合的氧化还原酶。迄今为止，大多数结构域插入研究靶标的是已知结构的相对较小的氧化还原酶，因此如何将这种蛋白质工程方法应用于需要动态构象变化才能发挥催化作用的大型异源寡聚蛋白仍不清楚。为回答这一问题，研究人员研究了肽段和结构域插入对大肠杆菌NADPH依赖性亚硫酸还原酶（SiR）活性的影响，该酶是一种十二聚体氧化还原酶，含有四个血红素蛋白亚基和八个黄素蛋白亚基。研究人员首先利用系统性八肽插入和细胞筛选评估了SiR的突变耐受性，鉴定了血红素蛋白结构中在插入后仍保留亲本样活性的区域。当将配体结合结构域插入到耐受肽段插入的骨架位置时，包括靠近和远离亚基间界面的位点，约90%保留了催化活性，超过50%表现出受内分泌干扰物调控的活性。利用一种结构域插入变体，研究人员可使用生物电化学反应器从细胞中电化学监测硫化物的条件性产生。这些结果表明，系统性肽段插入如何可用于指导大型异源寡聚蛋白复合物中的结构域插入，并展示了SiR如何被工程化改造以将环境中的化学信息转化为可扩散穿过细胞膜的氧化还原活性代谢物。
微生物在极其广泛的生物、化学和物理环境条件下繁衍生存。为适应这些动态波动的生态位，微生物进化出多样的感知系统以调控其生理活动。这种将环境化学信息转化为行为响应的能力促使微生物被开发为微米级传感器，应用于农业诊断、生物修复、健康监测和污染监测等诸多领域。传统生物传感器通常通过产生荧光、发光或色素蛋白等可视化输出来报告信号，近年来.indicator气体和氧化还原酶等替代输出方式也逐渐发展。
条件性转录调控因子可用于调控生物传感器中蛋白报告分子的合成，部分报告蛋白还可通过翻译后修饰进行调控。然而，许多天然蛋白缺乏此类信号处理所需的变构活性。为创建蛋白开关，研究人员可将一种蛋白的配体结合结构域插入另一种蛋白的功能结构域中，形成具有开关活性的多结构域蛋白。该技术已广泛应用于荧光蛋白、β-内酰胺酶、CRISPR相关蛋白、病毒衣壳蛋白、乙酰转移酶、铁氧还蛋白、离子通道和葡萄糖脱氢酶等多种蛋白。但在氧化还原酶靶标中，多数是单体或同源寡聚蛋白，且结构明确。
SiR（亚硫酸还原酶）催化亚硫酸根六电子还原为硫化物，其产物H?S是一种可扩散穿过细胞膜的氧化还原活性代谢物。该酶由SiR-FP（黄素蛋白亚基）和SiR-HP（血红素蛋白亚基）组成，形成含八个SiR-FP和四个SiR-HP亚基的复合物。SiR-FP提供催化还原当量，SiR-HP直接催化底物转化。研究团队选择该酶为对象，探索结构域插入在大型异源寡聚氧化还原酶中的应用可能性。
研究首先建立了基于大肠杆菌EW11菌株的生长互补筛选体系。该菌株缺乏功能性SiR，仅在表达cysJI操纵子（编码SiR-FP和SiR-HP）时方能在以硫酸盐为唯一硫源的培养基中生长，而R83A失活突变则消除该能力。研究团队构建了SiR-HP八肽插入文库，利用SGRPGSLS肽段（含独特限制性酶切位点以便后续结构域插入）进行系统性扫描。下一代测序（NGS）证实文库覆盖了98%的可能变体。通过与阴性对照（R83A突变体）和阳性对照（野生型SiR-HP）的比较，利用高斯混合模型分析发现，肽段插入耐受性在环状结构区域显著高于其他二级结构区域，且与辅因子（siroheme和4Fe-4S簇）距离呈负相关。值得注意的是，靠近活性位点的环状区域（≤10 ?）以及Fe-S簇上方的一个β折叠也呈现高富集分数，表明这些位置的插入变体仍具有功能。
研究进一步分析了SiR-HP/FP复合物的两个关键界面：介导异源二聚体结合的稳定结构界面，以及调控电子从SiR-FP向SiR-HP传递的动态界面。利用AlphaFold2预测的Fld结构域结合模型显示，FMN与4Fe-4S簇的intercofactor距离为8.8 ?，短于铁氧还蛋白依赖性SiR中的12-14 ?。出乎意料的是，靠近SiR-FP的FNR结构域接触残基的多个肽段插入位点呈现高富集值，且与前期氢-氘交换（HD exchange）数据比较，仅部分低HD交换残基呈现低插入耐受性。在介导电子传递的动态Fld结构域结合区域，十余个位点亦呈现高富集值，表明部分界面附近的肽段插入不影响蛋白复合物的关键相互作用。
基于上述系统性肽段插入结果，研究人员选择了靠近和远离两种界面的多个位点进行雌激素受体配体结合结构域（LBD）的结构域插入，选用的配体为内分泌干扰物4-羟基他莫昔芬（4-HT）。结果显示，约90%的变体保留催化活性，超过50%呈现配体依赖性活性。其中DV39（插入位点39）、DV259（插入位点259）等变体表现出最显著的开关表型。DV39位于SiR-HP/SiR-FP结构界面附近，DV259则靠近动态电子传递界面。
在配体特异性研究中，DV39和DV259对雌激素受体拮抗剂（他莫昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬）有响应，而激动剂（17β-雌二醇、己烯雌酚、己烷雌酚）和内分泌干扰物双酚A则无法激活，表明这些开关对拮抗剂构象具有特异性。
研究还展示了SiR开关在生物电子传感器中的应用。利用生物电化学系统（BES），表达DV39的大肠杆菌在4-HT诱导下产生显著高于对照组的电流密度信号，约在8小时后可被检测，实现了化学信号到电信号的转换。
讨论部分，研究人员将该工作与铁氧还蛋白开关等前期工作进行了比较，指出SiR系统仅需表达两种蛋白，远简于需要20种异源表达蛋白的铁氧还蛋白途径，但响应动力学较慢。对于插入耐受性的机制，研究推测十二聚体的高亲和力界面或亚基间的协同效应可能缓冲了突变的destabilizing效应。关于开关机制，DV39和DV259可能通过空间位阻调控十二聚体寡聚化，或通过变构效应调控活性位点构象，亦或调控电子传递门控机制，具体需进一步的体外生化研究阐明。研究最后指出，可通过优化开关表达、敲除H?S消耗酶、表达硫阴离子转运蛋白以及优化电极设计等策略改进该生物传感器系统。
研究结论表明，系统性肽段插入可指导大型异源寡聚蛋白中的结构域插入；SiR-HP中多个位点可耐受结构域插入并产生配体依赖性活性；工程化改造的SiR可将环境化学信息转化为可扩散的氧化还原活性代谢物，为生物电子传感应用提供了新途径。该论文发表于《ACS Synthetic Biology》。
