《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A perspective and demonstration of an approach to screening synthetic nucleic acid orders containing short nucleic acid sequences
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核酸合成订单的筛查正在扩展到包括短的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）订单，以确保潜在的有害基因和基因组不会被非法或不负责任的客户合成。短序列片段的信息丰富程度不如基因序列，通常需要组装才能发挥功能，并且其生产成本远低于基因。因
核酸合成订单的筛查正在扩展到包括短的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）订单，以确保潜在的有害基因和基因组不会被非法或不负责任的客户合成。短序列片段的信息丰富程度不如基因序列，通常需要组装才能发挥功能，并且其生产成本远低于基因。因此，研究人员提出观点，即序列片段的筛查需要一种不同于逐序列筛查的方法，需考虑订单内或其他订单中其他片段的背景信息。在筛查片段时应包含额外和替代性的指标，例如覆盖的基因/基因组比例以及可用于组装的证据，以实现高效且准确的生物安全（biosecurity）筛查。研究人员进一步演示了两种现有的生物安全工具，UltraQUICK和Aclid，它们提供的输出有助于更好地理解包含片段的订单所构成的威胁。本观点为应如何筛查短DNA片段（包括寡核苷酸池（oligo pools））奠定了基础，并使读者基于订单的功能和分类学特征，对这些订单的整体风险评估有所考量。
论文解读：合成核酸订单中短核酸序列筛查的新视角与方法演示
本文发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》。研究背景主要源于近年来全球范围内对合成核酸（包括DNA和RNA）订单生物安全筛查监管的不断加强。例如，美国卫生与公众服务部（HHS）于2023年更新了核酸筛查指南并扩大了范围，白宫科技政策办公室（OSTP）于2024年发布了《核酸合成筛查框架》，国际标准化组织（ISO）于2024年发布了包含序列筛查规定的ISO 20688-2:2024标准，且2025年的行政命令进一步呼吁修订框架以加强监督。此前的指南和筛查工具主要针对双链DNA（dsDNA）及较长序列（如200 bp或以上的基因），采用逐序列（sequence-by-sequence）的筛查模式。然而，当前的趋势要求将短序列（如50个核苷酸或更少）及单链DNA（ssDNA）纳入筛查范围。目前存在的主要问题是：短ssDNA序列信息量低，需组装才具功能，且生产成本极低（如寡核苷酸池（oligo pools）每碱基成本可低于0.0006美元），导致订单可能包含数十万甚至数百万条序列。若沿用传统的逐序列筛查模式，短序列因随机匹配率高会导致标记（flag）率显著上升（如从200 nt降至50 nt，标记率增加约2%），产生大量假阳性，造成极高的人工复核成本，且忽视了短片段需组装才能构成完整威胁的特性。因此，研究人员开展了探讨针对短核酸序列片段（尤其是ssDNA和oligo pools）的差异化筛查方法与风险评估框架的研究。
研究人员通过开展文献政策梳理、定义关键筛查指标、选取并演示现有生物信息学工具（UltraQUICK和Aclid）、构建包含受控与非受控生物类群的测试数据集（涵盖1000 nt非重叠段、51 nt非重叠段及oligo组装设计片段），并对工具进行验证与性能分析，得出以下结论：短核酸序列片段的筛查不应照搬基因长度的逐序列模式，而应基于订单整体背景，引入覆盖度、组装可能性（如重叠平铺）及分类学/功能上下文等指标进行综合风险评估；UltraQUICK和Aclid等工具能在订单水平提供基因/基因组覆盖度、分类学匹配、平铺（tiling）事件等量化输出，有助于区分良性研究与恶意全基因组组装意图；最终的风险评估应结合序列特征（威胁、组装覆盖度、功能、分类学）与客户特征（能力、资源、合法性、订单历史）进行综合判断。该研究的重要意义在于为合成核酸提供商和监管机构提供了短片段筛查的理论基础与实践工具参考，推动了生物安全筛查从单一序列匹配向上下文依赖的风险评价转变。
主要关键技术方法：
研究人员采用了生物安全筛查领域的观点阐述与工具演示方法。关键步骤包括：梳理近期美国及国际生物安全筛查政策与标准（如HHS 2023指南、OSTP 2024框架、ISO 20688-2:2024等）；明确短ssDNA/oligo pools与长dsDNA在功能、成本及筛查需求上的差异；提出以订单为单位的筛查指标（分类学识别、功能完整性、基因/基因组覆盖度、组装可能性）；选取两款商用/可用生物信息学筛查工具Aclid和UltraQUICK进行介绍与演示；构建验证数据集——选取8个基因组（4个受控分类学ID（TaxID）及4个相近非受控TaxID），生成三种子数据集（1000 nt非重叠段、51 nt非重叠段、经oligoOptimizer工具设计的组装用寡核苷酸），使用NIST标准测试集及自建数据集对工具输出指标（如分数覆盖度、平铺事件比例）进行分析与比较。
研究结果：
引言（Introduction）
研究人员通过回顾2023年至2026年间美国及国际机构发布的核酸筛查相关指南、框架、标准及法案（如HHS更新指南、OSTP框架、ISO标准、白宫行政命令及国会法案），指出筛查范围正从双链长序列（≥200 bp）向短单链DNA（≤50 nt）扩展，且需考虑跨订单与跨供应商的拆分组装风险。同时强调短ssDNA与长dsDNA在直接表达功能、成本及订单规模上的差异，提出核心问题：短ssDNA订单是否应与基因一样采用逐序列标记方式？研究人员认为短片段威胁轮廓不同，需在订单内或跨订单背景下评估，并需轻量级生物信息学工具提供组装与完整性证据。
筛查片段/寡核苷酸池（Oligo pools）时需考虑哪些重要信息？（What information is important to consider when screening fragments/Oligo pools?）
研究人员指出，除类似基因筛查的分类学识别（确定序列最佳匹配或特有归属的生物）和功能（序列编码蛋白是否可能具功能）外，对短片段尤为重要的是覆盖度（coverage）与组装（assembly）。功能方面，研究人员提出若非病毒非毒素基因片段小于完整开放阅读框（ORF）的50%，可保守估计编码蛋白无功能（基于假基因与突变数据）。覆盖度方面，需评估订单中序列在基因和基因组水平的覆盖比例（如>50%基因覆盖数、受控序列覆盖比例）。组装方面，研究人员通过两个场景（非重叠覆盖vs重叠覆盖同一目标序列）说明，重叠片段更利于组装，应在风险评价中考虑。
寡核苷酸池（Oligo pools）筛查工具示例输出（Example screening tool outputs for oligo pools）
研究人员介绍了两款工具：Aclid采用基于序列的方法，使用公开与专有数据集的参考序列及注释，可在50 nt或16氨基酸窗口标记受规管药剂的最佳匹配，并提供比对指标、功能数据、物种/受规管药剂的聚合基因与基因组覆盖度、统计摘要等。UltraQUICK为UltraSEQ的轻量级配套工具，侧重订单水平快速指标；使用lambda2 aligner比对至SoC（Sequence of Concern）数据库与Curated UniRef100数据库，过滤<30 nt比对，设定E-value与百分比一致性阈值，编译受控TaxID命中并进行至少7 nt重叠的平铺检测（tiling detection），输出JSON风格报告，包含查询命中数、分数覆盖、平铺事件分数等。研究人员使用NIST数据集验证UltraQUICK，性能为：FP率0.054，FN率0.020，准确率0.963，灵敏度0.980。
两款筛查工具用于寡核苷酸池（Oligo pool）分析的演示（Demonstration of two screening tools for oligo pool analysis）
研究人员构建“受控/非受控药剂”数据集（8个基因组，3种子数据集类型）。结果显示：两款工具的受控药剂分数覆盖度（UniRef/SoC命中分数、基因组覆盖分数）在受控数据集普遍高于非受控数据集，且与设定基因组覆盖度大致相关；平铺指标（Fraction UniRefs with Tiling / Fraction SoC with Tiling）可区分具组装设计的数据集（CCA）与无重叠数据集（C、CC）。这表明订单水平的覆盖与平铺指标可辅助判断意图（如靶向基因突变研究 vs 全基因组恶意组装）。
讨论（Discussion）
研究人员总结认为，短序列片段（oligo pools）筛查不同于逐基因筛查，应基于订单整体（或跨订单流）分析。风险评估应同时考虑序列剖面（威胁、组装覆盖度、功能、分类学）与客户剖面（能力、资源、合法性、订单历史），公式为：订单风险 = 威胁 × 概率。研究人员主张序列构成“威胁”通常需具功能性（编码完整功能蛋白），除毒素及可转移致病基因外，最终功能是有机体本身；因此需结合特定基因威胁功能（毒素、免疫逃逸等）与组装生物特征（致病性、传播性等）理解风险。工具提供的基因/基因组水平指标可为生物安全官员判断意图（如SARS-CoV-2多标记序列是最小基因组覆盖的突变研究，还是近全覆盖的基因组组装）提供基础。最后研究人员指出，未来核酸订单风险评估讨论应纳入威胁序列覆盖度及从核酸订单流组装的可能性，以确保客观、合理与高效的生物安全风险评价。
研究结论（翻译总结）：
- 1.
短核酸序列片段（如ssDNA、oligo pools）的筛查不应沿用传统逐序列基因筛查模式，而需在订单内或跨订单背景下，结合覆盖度、组装可能性、分类学及功能上下文进行评价。
- 2.
筛查短片段时应加入替代指标：基因/基因组覆盖比例、可用于组装的证据（如重叠平铺），以提升生物安全筛查的效率与准确性。
- 3.
UltraQUICK与Aclid等工具可提供订单水平的量化输出（覆盖度、平铺事件、分类学/受控序列命中），有助于理解含片段订单的威胁程度，并可区分不同意图的订单。
- 4.
核酸订单的整体风险评估应包含序列剖面（威胁、组装覆盖度、功能、分类学）与客户剖面（能力、资源、合法性、订单历史），综合判断风险。
- 5.
未来核酸订单风险评价框架应明确纳入威胁序列覆盖度及从订单流组装的可能性，以支撑客观、合理与高效的生物安全决策。
