基于PCR、实时荧光定量PCR及环介导等温扩增技术的多用途诊断标记开发用于水稻植株及土壤中立枯丝核菌的快速检测

《Frontiers in Plant Science》：Development of a multipurpose diagnostic marker using PCR, real-time PCR, and LAMP assays for rapid detection of Rhizoctonia solani in rice plants and soil

　　

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG1-IA是引起水稻纹枯病的主要土传病原菌，在全球范围内造成显著产量损失。早期、快速且精准的检测对于有效病害管理至关重要，而传统检测方法耗时长且灵敏度有限。本研究开发并验证了一种高特异性分子标记BrD3，该标记靶向含溴结构域的主要易化 superfamily（Major Facilitator Superfamily, MFS）基因，可在PCR、实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）及环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）体系中，实现对染病水稻植株及土壤样本中病原菌的检测。PCR体系可检测到低至100 pg的DNA，qPCR体系则表现出更高灵敏度，可检测10 pg DNA，并具有高效性与准确性（R2> 0.99）。该标记还被用于水稻纹枯病抗性评估，接种条件下，易感品种Pusa Basmati 1121中靶基因拷贝数最高，而抗病品种Tetep中拷贝数最低。LAMP体系在63°C条件下优化，采用羟基萘酚蓝（Hydroxy Naphthol Blue, HNB）染料，可实现快速可视化检测，灵敏度为1 ng DNA，且与其他水稻病原菌无交叉反应。三种检测体系均在多个水稻基因型及稻麦轮作系统的土壤样本中进行了验证。该研究提出的综合诊断方法为AG1-IA型立枯丝核菌的早期检测及土壤种群监测提供了稳健、特异且适用于田间应用的解决方案，有助于及时实施病害管理措施。

水稻是全球重要的粮食作物之一，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的纹枯病是限制水稻高产稳产的主要病害之一，该病原菌属担子菌门，可划分为14个菌丝融合群（anastomosis groups, AGs），其中AG1-IA是水稻纹枯病的优势致病类群。由于该菌遗传变异大，可在土壤及病残体中形成抗逆性强的菌核长期存活，化学防治效果不稳定，因此早期精准检测病原菌对于病害预测与防控尤为关键。现有分子检测方法多针对单一技术或特定基因组区域，缺乏能在PCR、qPCR和LAMP中通用的特异性标记，尤其在土壤样本检测方面尚存不足。为此，研究人员基于比较蛋白质组学分析，筛选并获得了一个AG1-IA特异的溴结构域蛋白编码基因（AG1_BrD），并以此为基础开发了跨平台兼容的分子标记BrD3。

研究中，样本来源于印度农业研究所（ICAR-IARI）田间采集的水稻植株及稻麦轮作系统土壤，包含多个水稻品种及不同寄主来源的立枯丝核菌分离株，同时涵盖多种常见水稻病原菌作为特异性对照。关键技术方法包括：基于CTAB法提取真菌及植物组织基因组DNA，采用Zymo土壤DNA提取试剂盒处理土壤样本；利用生物信息学工具设计并筛选特异性引物；分别建立并优化PCR、qPCR（SYBR Green法）和LAMP（羟基萘酚蓝显色）检测体系；通过梯度稀释模板测定灵敏度，并以多病原菌DNA验证特异性；在田间接种实验中结合qPCR定量分析不同抗性水稻品种中的病原菌负荷，并在不同季节的土壤样本中监测病原菌种群动态。

结果部分显示，BrD3标记在PCR体系中可特异性扩增AG1-IA型立枯丝核菌，产物大小为110 bp，对其他水稻病原菌及寄主植物DNA无交叉扩增。该标记可检测来自水稻、姜黄、芥菜、生姜等不同寄主的AG1-IA菌株，PCR灵敏度为100 pg DNA。在田间植株和土壤样本中，PCR均能稳定检出目标片段，其中土壤样本在接种9个及以上菌核时可被检出。qPCR体系在植物和土壤样本中均表现出高线性相关性（R²分别为0.9991和0.9999），扩增效率超过110%，灵敏度为10 pg DNA。qPCR定量结果显示，易感品种Pusa Basmati 1121中病原菌拷贝数最高（约2.61×10⁵），抗病品种Tetep中最低（约2.40×10³）；在稻麦轮作系统中，病原菌种群量在7月最高（约2.99×10⁵拷贝），次年3月降至最低（约800拷贝）。LAMP体系经优化后可在63°C恒温反应60分钟内完成检测，HNB染料显色结果与电泳一致，灵敏度为1 ng DNA，仅对AG1-IA菌株呈阳性反应，在田间样本检测中与预期抗性表型相符。

讨论部分指出，BrD3标记基于MFS转运蛋白家族基因，不同于常用的ITS区标记，具有更高的AG群特异性，可在同一序列上实现三种检测平台的兼容应用，弥补了以往检测方法的局限。qPCR不仅能精准量化植株中的侵染程度，还可监测土壤中病原菌的季节变化，为病害预测提供数据支持。LAMP体系配合HNB显色，无需昂贵仪器即可完成现场检测，适合田间快速筛查。研究证实，该标记可用于水稻抗纹枯病种质资源的筛选、播种前土壤带菌量评估及生长季病害监测，为水稻纹枯病的综合管理提供了可靠的技术支撑。

结论部分表明，本研究成功开发并验证了基于BrD3标记的PCR、qPCR及LAMP一体化检测体系，可在植株及土壤样本中高效、特异地检测AG1-IA型立枯丝核菌，其灵敏度和稳定性均满足田间应用需求。该技术有望在病害预警、抗性育种及可持续病害管理中发挥重要作用，从而降低水稻纹枯病的危害，提高产量与品质。论文发表于《Frontiers in Plant Science》。