无标记荧光寿命成像技术用于细胞核研究：一种灵敏的代谢反应检测方法

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Label-free fluorescence lifetime imaging of cells nuclei: A sensitive readout of metabolic response

　　

伊奥安娜·A·戈尔布诺娃（Ioanna A. Gorbunova）|埃莱娜·E·尼科诺娃（Elena.E. Nikonova）|玛丽娜·V·希尔马诺娃（Marina V. Shirmanova）|弗拉基斯拉夫·I·谢斯拉夫斯基（Vladislav I. Shcheslavskiy）|阿纳斯塔西娅·D·科马罗娃（Anastasia D. Komarova）|伊琳娜·N·德鲁日科娃（Irina N. Druzhkova）|彼得·S·蒂马舍夫（Peter S. Timashev）|叶夫根尼·A·希尔申（Evgeny A. Shirshin）

俄罗斯莫斯科谢切诺夫第一国立医科大学再生医学研究所

摘要

利用NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）及其磷酸化形式NADPH的内源性荧光进行荧光寿命成像显微镜（FLIM）研究，是监测细胞代谢状态的强大工具。为了更细致地解读FLIM数据，研究不同细胞区室中的NADH至关重要。在本研究中，我们证明了细胞核中通常被忽略的微弱NADH荧光可以通过相位图方法可靠地进行分析，并能敏感地反映代谢反应。通过使用经代谢抑制剂罗通宁（rotenone）和3-溴吡ruvate以及化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的结直肠癌细胞HCT116，我们发现细胞核中的NADH荧光衰减会随治疗而变化。对于5-FU而言，对细胞核NADH的相位分析显示了两种亚群的异质性反应，这些亚群在NADH荧光衰减参数、荧光强度以及细胞质与细胞核的荧光强度比方面存在差异。值得注意的是，细胞核和细胞质的反应高度相关，表明它们的NADH池之间存在紧密耦合。总体而言，我们的结果确立了细胞核NADH荧光作为细胞代谢的稳健无标记指标的地位，并强调了其在NADH荧光分析受外源性荧光标记物光谱重叠限制条件下的应用潜力。

引言

荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术广泛用于监测细胞分化、氧化应激、组织再生和药物反应过程中的细胞代谢状态，研究对象包括内源性荧光团如NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）及其磷酸化形式NADPH（统称为NADH）和氧化型黄素[1]、[2]、[3]、[4]。该技术的优势在于无需标记、无创性、对代谢扰动的高敏感性以及亚细胞分辨率[5]、[6]。在FLIM实验中，使用共聚焦显微镜结合时间相关单光子计数（TCSPC）系统逐像素测量活细胞或组织中的内源性荧光衰减。NADH的荧光衰减通常可以用双指数函数描述，其中较短的亚纳秒级衰减时间（τ? ≈ 0.4 ns）对应于游离NADH，而较长的纳秒级衰减时间（τ? ≈ 2 ns）对应于与蛋白质结合的NADH[7]、[8]、[9]、[10]。这两种衰减时间的显著差异使得可以利用FLIM技术区分游离NADH和结合NADH池[10]、[11]、[12]。细胞能量代谢或氧化还原状态的变化通常会导致游离NADH与结合NADH的比例发生变化[13]。特别是癌细胞通常表现出比正常细胞更高的比例值，这反映了瓦尔堡效应（Warburg effect），即细胞代谢偏向于糖酵解和葡萄糖消耗[11]、[14]、[15]。

在细胞内，NADH最强的荧光通常出现在线粒体中，而最弱的荧光信号则出现在细胞核中[16]、[17]。大多数FLIM研究集中在整个细胞质或分离的线粒体中的NADH荧光分析上[15]、[18]，因为这些区室直接参与细胞呼吸[14]、[19]，而细胞核的荧光则被排除在外。然而，细胞核是NADH FLIM研究的有趣目标，因为在该区室测量的荧光参数可能直接反映细胞能量代谢与其他NAD依赖性过程之间的联系。具体而言，NAD+是多种参与DNA损伤修复、基因表达和应激反应的酶的底物[20]。在细胞核中，NAD+对于转录调节因子（如C末端结合蛋白CtBP）以及sirtuins（SIRT）和poly(ADP-ribose)聚合酶（PARP）的活性是必需的[21]、[22]、[23]。研究表明，细胞核中的NADH荧光对多种处理方式（包括代谢抑制剂、NAD+合成抑制、化疗药物和DNA损伤剂）具有敏感性[24]、[25]，进一步证明了其功能重要性。表1总结了近期关于细胞核NADH荧光的FLIM研究结果。

普遍观点认为，由于NADH可以通过核孔自由扩散，细胞质和细胞核中的NADH池处于平衡状态[17]、[20]。相比之下，线粒体中的NADH池通常被认为是独立的且被隔离的[26]。多项FLIM研究支持这一观点，这些研究表明细胞核中的游离NADH比例（a?）高于细胞质[17]、[27]，并且细胞核与细胞质中NADH荧光衰减参数（a?/a?和τ?）的变化之间存在强相关性（见表1中的参考文献）。除了游离NADH的被动扩散外，细胞核中的NADH动态可能间接反映NAD依赖性调节途径的变化[24]。维持细胞核中的NAD+池需要不断调整细胞的氧化还原状态和能量平衡[20]。然而，一个基本问题仍未解决：细胞核中测量的NADH荧光是否能够提供关于细胞对外部刺激反应的额外信息，或者它主要反映了细胞质中的代谢变化。在前一种情况下，细胞核自荧光可以独立指示细胞反应；而在后一种情况下，它可以作为细胞质读数的替代指标，例如当线粒体或其他细胞器被不同荧光团标记从而干扰NADH信号时。

在这里，我们证明了可以使用相位图方法可靠地分析细胞核中的NADH荧光，并提供了有关细胞代谢反应的宝贵信息。通过使用经代谢抑制剂（罗通宁、3-BP）和化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的HCT116细胞，我们发现细胞核中的NADH荧光衰减对代谢扰动敏感，并表现出与细胞质中观察到的行为相似的特征。我们的结果表明，细胞核中的NADH荧光能够独立且敏感地反映细胞代谢反应。

章节片段

细胞培养和处理

HCT116人结直肠癌细胞系在添加了10%胎牛血清（HyClone）、2 mM谷氨酰胺、10 mg/mL青霉素和10 mg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；PanEco）中培养。细胞在37°C、5% CO?气氛和80%相对湿度下培养，每周传代三次。

对于荧光显微镜实验，将5 × 10^5个细胞接种到2 mL培养基中，置于35 mm的FluoroDish（World Precision Instruments，美国）培养皿中。

细胞核和细胞质自荧光信号的光谱参数

在750 nm激发下，细胞自荧光主要来源于细胞质中的NADH，尤其是在线粒体内[17]。相比之下，细胞核中自荧光信号的来源尚不明确。这一问题是由于在常用的NADH FLIM条件下，DNA和蛋白质的氧化修饰也可能产生荧光[37]。为了解决这个问题，我们进行了...

讨论

非侵入性、无标记技术的广泛应用促进了FLIM技术的普及[2]、[18]、[41]。因此，人们非常关注能够提高NADH FLIM灵敏度和生物学特异性的方法学方法。

结论

总之，通过对FLIM数据进行相位图分析，我们证明了细胞核中的NADH荧光能够敏感地反映细胞对代谢抑制剂和化疗治疗的反应。重要的是，我们首次发现，通过分析细胞核中的NADH荧光可以揭示细胞对5-FU治疗的显著异质性反应。仅基于细胞核荧光衰减参数，我们识别出了两个不同的细胞亚群...

CRediT作者贡献声明

伊奥安娜·A·戈尔布诺娃（Ioanna A. Gorbunova）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据管理、概念构思。埃莱娜·E·尼科诺娃（Elena.E. Nikonova）：初稿撰写、可视化、实验研究、数据管理。玛丽娜·V·希尔马诺娃（Marina V. Shirmanova）：撰写 – 审稿与编辑、实验研究、数据管理、概念构思。弗拉基斯拉夫·I·谢斯拉夫斯基（Vladislav I. Shcheslavskiy）：撰写 – 审稿与编辑、实验研究、数据管理、概念构思。阿纳斯塔西娅·D·科马罗娃（Anastasia D. Komarova）：可视化、资源准备、实验研究、数据管理。伊琳娜·N.

[29], [32]

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

伊奥安娜·A·戈尔布诺娃报告称获得了俄罗斯科学基金会的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了俄罗斯科学基金会的资助（项目编号：25-79-10362）。