欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）孵化酶的作用：受精后至孵化前的转录组学与酶学分析

《Aquaculture》：The role of hatching enzyme in European eel (Anguilla anguilla): Transcriptomic and enzymatic analysis after fertilisation and before hatching

　　

硬骨鱼类胚胎利用保守的锌结合虾红素蛋白酶（astacin proteinase）对组成辐射带（zona radiata, ZR）的糖蛋白进行化学修饰。欧洲鳗鲡作为一种进化上较为原始的降海洄游性物种，拥有多种具有相似催化功能的同工酶来完成这一任务。目前，研究人员正致力于开发有效的养殖技术以拯救这一极度濒危物种，因其辅助繁殖过程中的胚胎孵化率和存活率变异较大。因此，本研究旨在探究孵化率的变异是否由高几丁质溶解酶1样蛋白（high choriolytic enzyme 1-like, HCE-1-like）即鳗鲡孵化酶（eel hatching enzyme, EHE）的表达缺失或其胶原蛋白酶样（collagenase-like）活性不足所致，同时检测发育中胚胎在受精后至孵化前的细胞内Zn²⁺浓度调控情况。研究开展了6次辅助繁殖，收集受精后2小时（t0）和孵化前（t55）的漂浮（有活力）和下沉（无活力）受精卵池。采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）、胶原蛋白降解荧光测定法以及电感耦合等离子体发射光谱法（Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry, ICP-OES）检测细胞内Zn²⁺浓度。所有样本池中均检测到鳗鲡孵化酶的转录产物，且即使在受精后2小时，有活力与无活力胚胎之间即存在显著差异，提示其母源来源或母体合子转换（maternal-to-zygotic transition, MZT）之前的孵化酶表达启动。相对mRNA量受所有因素（时间、状态、交互作用）影响，总体呈表达上升趋势。胶原蛋白酶样活性仅受时间因素影响，且仅有无活力样本的细胞内Zn²⁺浓度高于0.6 mg kg^?1，提示与其他物种相似的阈值。相关性分析显示Zn²⁺浓度与繁殖雌性在排卵时的体重呈负相关。

欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）作为典型的降海洄游性鱼类，因自然资源量急剧衰退及玻璃鳗补充量锐减，已被国际自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature, IUCN）列为"极度濒危"物种。实现其全人工繁殖并建立稳定的苗种培育体系已成为水产养殖领域的重要课题。然而，尽管研究人员已成功获得欧洲鳗鲡鳗柳叶状仔鱼的首次摄食阶段，但胚胎存活率与孵化率的波动性仍是制约其生活史闭环的关键瓶颈。硬骨鱼类胚胎孵化需依赖孵化酶（hatching enzyme, HE）对卵膜外层——尤其是辐射带（zona radiata, ZR）——的糖蛋白进行化学消化，其中虾红素金属蛋白酶家族（astacin proteinase family）的HExxHxxGFxHExxRxDR保守序列及其锌结合基序（HExxH）在催化活性中起核心作用。值得注意的是，在代表进化基部类群的鳗鲡目中，日本鳗鲡（Anguilla japonica）已被证实存在多个分子量相近、几丁质溶解功能相似的鳗鲡孵化酶（eel hatching enzyme, EHE）同工酶，其由单一多拷贝基因——高几丁质溶解酶1样基因（high choriolytic enzyme 1-like gene, EHE）编码，转录本于受精后20小时在胚胎前脑前端首次检出。与此同时，锌离子（Zn²⁺）作为孵化酶活性中心的必需辅因子，其细胞内稳态调控对孵化腺细胞（hatching gland cells, HGC）的分化迁移及胚胎正常发育至关重要，但过高浓度的Zn²⁺又会延迟甚至抑制孵化。在此背景下，探究欧洲鳗鲡辅助繁殖中孵化酶表达及其活性与胚胎活力之间的关系，对于优化人工繁殖技术、提升苗种质量具有重要意义。该论文发表于《Aquaculture》。

关键实验技术方法如下：研究人员对6尾经激素诱导成熟的雌性欧洲鳗鲡开展人工繁殖，采集受精后2小时（t0）及孵化前55小时（t55）的漂浮（有活力）与下沉（无活力）胚胎样本队列；采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测EHE基因及参考基因的mRNA表达水平，计算ΔCT值及2^?ΔΔCT相对定量；运用胶原蛋白降解荧光测定法（Collagen degradation fluorometric assay）检测胶原蛋白酶样活性，以荧光素释放量定量酶活性单位（U/mg蛋白）；通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定细胞内Zn²⁺浓度（μg g^?1湿重），样本经微波消解处理后上机检测。数据分析采用R软件及GraphPad Prism进行混合效应分析、Sidak多重比较、Spearman相关性检验等。

研究结果部分具体如下：

**繁殖性能**：6尾雌性鳗鲡经鲤鱼脑垂体提取物（Carp pituitary extract, CPE）诱导18–23周后完成繁殖，平均产卵量占排卵诱导时体重的39.40%，但受精率偏低导致整体繁殖表现不及先前研究。各次繁殖的受精率、漂浮率及孵化率存在个体差异。

**鳗鲡孵化酶表达**：除t55无活力组一个样本池外，其余所有样本池均检测到EHE转录产物，熔解温度（Tm）约为81°C。t0时期无论有活力与无活力组，EHE mRNA含量均低于t55时期。Sidak多重比较显示t0有活力与无活力组（p = 0.0103）、t0与t55有活力组（p = 0.0016）、t0有活力与t55无活力组（p = 0.0037）间存在显著差异，而t55两组间无显著差异（p = 0.8107）。时间（p = 0.0009）、状态（p = 0.0244）及交互作用（p = 0.0377）均对EHE mRNA含量有显著影响。以t0无活力组为校准，t0有活力组平均高6倍表达，t55有活力组最高达257.33倍，t55无活力组为176倍，且后者变异范围更大（54–571倍）。

**总蛋白含量与孵化酶胶原蛋白酶样活性**：24个样本池均成功测定总蛋白，但仅18个样本池检测到胶原蛋白酶活性，其余6个样本池（分布于不同时期和状态）呈阴性而被排除统计分析。混合效应双因素方差分析显示总蛋白含量无显著组间差异，而胶原蛋白酶活性仅受时间因素影响显著（p = 0.0418），t55时期显著高于t0时期，但状态及交互作用无显著影响。

**细胞内Zn²⁺浓度**：23个样本池成功测定。无活力胚胎在t0时期平均Zn²⁺浓度最高（范围0.0526–0.7530 mg kg^?1）。尽管统计检验无显著组间差异，但有活力组在t0和t55时期Zn²⁺浓度均未超过0.6 mg kg^?1，而无活力组两个时期均有个别样本池高于此阈值。

**相关性分析**：雌性鳗鲡排卵诱导体重（FWDHP）与t0有活力组Zn²⁺浓度呈显著负相关（Spearman ρ = ?0.9429, p = 0.0167），与t0无活力组、t55无活力组及t55有活力组亦呈负相关但未达显著水平。此外，FWDHP与t0无活力组总蛋白含量、t0无活力组胶原蛋白酶样活性等存在相关关系，但样本量限制了部分相关性的统计显著性。

讨论部分，研究人员指出孵化率变异并非由EHE表达或其胶原蛋白酶样活性不足所致，因上述指标均随发育时间递增，且未在活力状态间产生差异。尤其重要的是，EHE转录本在受精后2小时即被检出，显著早于已知的鳗鲡母体合子转换启动时间（约8小时后），这一发现提示两种可能的解释：其一为母源mRNA沉积于成熟卵子中，胚胎活力依赖于母源EHE mRNA的丰度；其二为EHE在合子基因组激活前即开始表达，类似于海胆孵化酶的独特特征。该研究还强调，胶原蛋白酶样活性的测定无法区分EHE与其他基质金属蛋白酶（如MMP1、MMP8、MMP13）或丝氨酸内切蛋白酶（如zonase）的活性，无活力组较高的酶活性可能反映细胞凋亡过程中的蛋白酶激活而非正常的几丁质溶解功能。关于Zn²⁺浓度，研究发现仅无活力样本超过0.6 mg kg^?1阈值，与斑马鱼等物种的水体锌毒性无效应浓度相呼应，提示细胞内Zn²⁺稳态失衡可能损害胚胎活力。相关性分析中FWDHP与Zn²⁺浓度的负相关尤为引人关注，暗示母体营养状况可能通过影响卵子质量进而调控胚胎锌代谢。研究亦承认t55时期样本活力状态判定的局限性，因孵化器水流运动可能使部分活力受损胚胎仍保持漂浮。

研究结论部分翻译如下：虽然可变的孵化率似乎并非由于EHE表达或活性缺失导致辐射带化学消化不足，但孵化的物理与动态方面——如卵膜层厚度及胚胎运动能力——可能在不同成熟诱导方案间存在差异，并成为影响孵化率的决定因素。鳗鲡孵化酶转录产物在目前已知的合子基因组激活之前即存在于胚胎中，提示母源来源，或类似于海胆孵化酶的母体合子转换前表达特征。不同发育时间点的下一代测序技术可为合子基因组激活时机提供直接证据，并进一步探究DNA甲基化与染色质结构介导的孵化酶表达调控。结合所发现的相关性及细胞内Zn²⁺浓度的初步认识，这些结果进一步强调了在选择水产养殖及增殖放流用亲鱼时雌性鳗鲡营养状况的重要性。