综述：利用CRISPR/Cas9技术优化过继性T细胞疗法：从分子工程到临床生产

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Leveraging CRISPR/Cas9 for optimized adoptive T cell therapies: From molecular engineering to clinical manufacturing

　　

金智贤（Ji-Hyeon Kim）| 赵孝贞（Hyo Jung Cho）| 李香美（Hyang-Mi Lee）

韩国首尔东德女子大学药学院，邮编02748

摘要

癌症免疫疗法正迅速从药物免疫调节发展为过继细胞疗法（Adoptive Cell Therapy, ACT）。在ACT中，T细胞在体外被扩增并经过基因工程改造，以实现持久的抗肿瘤活性。主要的ACT平台包括肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、嵌合抗原受体（CAR）T细胞和T细胞受体（TCR）T细胞，它们依赖于T细胞的效应功能，但在抗原识别机制、HLA依赖性和工程要求上存在差异，从而导致各自的临床优势和局限性。CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了精确的敲除（KO）和敲入（KI）策略，可以实现全基因组的多重编辑和功能调控。在ACT制造领域，CRISPR/Cas9解决了T细胞耗竭、移植物抗宿主病（GvHD）以及确保产品一致性和质量等关键问题。本文探讨了如何利用CRISPR/Cas9克服ACT的局限性，并总结了目前CRISPR工程化ACT产品的临床现状。最后，我们讨论了基于CRISPR的基因编辑所面临的持续挑战，并提出了潜在的解决方案。

引言

癌症免疫疗法是一种通过增强宿主免疫系统的抗肿瘤功能或纠正肿瘤产生的免疫抑制环境来消除肿瘤的治疗策略。这使其区别于传统的直接切除肿瘤的方法。临床上，免疫疗法的主要类别包括免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、癌症疫苗和细胞疗法。所有这些方法都有一个共同的目标，即调节免疫反应的质量和方向[1]、[2]。ACT是一种利用免疫细胞作为治疗剂来达到抗肿瘤效果的策略。ACT通过选择、激活和扩增来自患者或供体的免疫细胞来诱导抗肿瘤免疫反应。必要时，这些细胞可以通过基因工程进行改造，然后再重新注入体内。目前代表性的ACT平台包括TIL疗法、CAR-T疗法和TCR-T疗法。尽管这些疗法都以T细胞为核心效应器，但它们在临床特征和应用范围上存在差异，这取决于抗原识别机制、HLA依赖性和基因工程策略[3]。TCR-T疗法特异性识别肽-HLA（pHLA）复合物，其中肽来自细胞内蛋白质，由HLA分子呈递。与仅限于细胞表面抗原的CAR-T疗法相比，这使得TCR-T疗法能够针对更广泛的靶抗原。尽管这一特性表明其在实体瘤中的潜在应用前景，但仍存在显著的限制，包括内源性T细胞TCR错配、脱靶毒性、T细胞持久性有限以及肿瘤的免疫逃逸机制（如HLA限制和抗原呈递受损）[4]、[5]。同时，基因编辑技术的进步为克服这些限制带来了新的可能性。早期的基因编辑工具，如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs），展示了靶向基因操作的潜力，但受到复杂设计和效率有限的制约[6]、[7]。CRISPR/Cas9系统是一项突破性技术，它允许使用简单的引导RNA设计进行精确高效的基因序列编辑。这一创新从根本上改变了基因编辑领域。在TCR-T疗法中，CRISPR/Cas9有助于去除内源性TCR以防止错配，减少脱靶毒性，并增强T细胞的功能和持久性。它被认为是同时提高TCR-T疗法安全性和有效性的关键工具。本文回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理和机制，并探讨了其在未来临床发展中的潜力，特别是在利用该技术解决过继T细胞疗法的局限性方面[8]、[9]、[11]。

章节摘录

用于T细胞工程的CRISPR/Cas9平台

应用于ACT的CRISPR/Cas9技术通过三种主要编辑方式发挥作用：基于核酸酶的基因编辑、可编程基因调控和精准编辑方法（图1）。

ACT中作为基因工程目标的生物学和临床障碍

ACT，包括TIL、CAR-T和TCR-T方法，在血液系统恶性肿瘤中显示出显著的临床疗效，并且越来越多地扩展到实体瘤。TIL疗法涉及分离和扩增肿瘤驻留淋巴细胞，通常使用高剂量IL-2处理，然后在淋巴细胞清除后重新输注[3]、[35]。CAR-T细胞被设计为表达由抗体衍生的结合域（scFv）与...

逆转T细胞耗竭

T细胞耗竭仍然是ACT疗效的核心障碍，也是基因工程的主要目标[41]、[42]、[56]。如第3.1节所述，耗竭是一个连续的过程，基因编辑的治疗效果很大程度上取决于所针对的细胞状态。针对抑制性受体的基因破坏策略，尤其是编码PD-1的PDCD1，可以增强效应功能、细胞因子的产生以及TIL、CAR-T...

基于CRISPR的ACT策略可以分为互补的工程层次：基因破坏以去除抑制性或不安全的途径、靶向敲入以控制受体或载荷表达、可编程调控以调节细胞状态、精准编辑以降低DNA双链断裂（DSB）相关风险，以及功能筛选以确定合理的目标。这些方法的最佳组合因TIL、CAR-T和TCR-T平台的不同而异，反映了它们各自的生物学限制。

CRISPR/Cas9基因编辑T细胞疗法的临床试验

在临床阶段，CRISPR/Cas9基因编辑的应用范围越来越广，包括功能增强、异体“通用”产品的开发以及通过定义明确的编辑架构提高产品一致性。当前的试验大致可以分为以敲除（KO）为中心的设计和结合敲除/敲入（KO/KI）的设计。以敲除为中心的设计旨在去除抑制性或与兼容性相关的基因，如PDCD1、SOCS1、CISH、TRAC/TRBC和B2M，而...

基于CRISPR的基因编辑不仅需要精确的“分子水平”设计，即在目标序列上进行靶向切割和修复，还需要考虑与制造相关的因素。这些因素包括递送性能、细胞状态、DNA修复途径的选择以及编辑产物的谱型，所有这些最终都会影响效率和安全性[108]。在细胞疗法中，工艺条件直接影响产品的质量和安全性[174]。

结论

CRISPR/Cas9已成为一种强大的平台，用于工程化过继T细胞疗法，特别是TCR-T方法，通过实现高效和可编程的基因敲除和敲入策略。这些应用解决了ACT的关键局限性，包括TCR错配、T细胞持久性有限、免疫抑制问题，以及通过靶向编辑TRAC和B2M等位点开发异体“即用型”产品。

然而，临床转化仍面临重要挑战。

金智贤（Ji-Hyeon Kim）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、概念构思。赵孝贞（Hyo Jung Cho）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、概念构思。李香美（Hyang-Mi Lee）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

在准备本文的过程中，作者使用了ChatGPT辅助的语言编辑工具来提高清晰度和可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

本项工作得到了韩国食品药品安全部的资助（项目编号RS-2024-00393630）。

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