《Bioresource Technology Reports》：Mitigate microbial contamination and fuel degradation in marine diesel B20: Evidence from multi-analytical and metagenomic approaches
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根据2024年版ISO 8216:2024标准，船用燃料中脂肪酸甲酯（FAME）允许掺混比例大幅提高，这虽然促进了可再生燃料的应用，但也使燃料在储存期间更易发生氧化降解与微生物污染。研究人员评估了抗坏血酸（AA）、苯甲酸（BA）和特丁基对苯二酚（TBHQ）三种
根据2024年版ISO 8216:2024标准，船用燃料中脂肪酸甲酯（FAME）允许掺混比例大幅提高，这虽然促进了可再生燃料的应用，但也使燃料在储存期间更易发生氧化降解与微生物污染。研究人员评估了抗坏血酸（AA）、苯甲酸（BA）和特丁基对苯二酚（TBHQ）三种抗氧化剂在60天模拟储存期内对船用B20柴油化学稳定性及微生物活性的多重作用。经1000 mg·L?1浓度下的抗菌初筛后，选取效果较优的抗氧化剂在接种燃料源微生物群落的油-水双相微宇宙体系中进行深入验证。研究通过腺苷三磷酸（ATP）含量、脂肪酶活性及干生物量来量化微生物活性，并利用气相色谱-质谱联用（GC–MS）组成比值、傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合均匀流形近似与投影（UMAP）以及标准理化参数评估燃料稳定性。结果显示，与未处理对照组相比，处理30天后TBHQ使ATP水平降低87%，AA降低73%，BA降低64%；脂肪酶活性由对照组的9.91 U·mL?1分别降至TBHQ的4.30 U·mL?1、AA的3.86 U·mL?1及BA的2.92 U·mL?1。储存60天后，TBHQ处理组干生物量由对照组的211 ± 21 mg降至106 ± 18 mg，AA处理组降至143 ± 34 mg。GC–MS分析表明处理组保留了不饱和FAME组分，且处理燃料维持了较低的酸度、黏度及含水量。上述结果表明，抗氧化剂的添加尤其是TBHQ，能够同时增强氧化稳定性并抑制微生物增殖，支持其作为高FAME船用燃料体系多功能稳定添加剂的应用。
航运业承担着全球约80%的贸易运输量，但相应地也带来了大量温室气体排放。国际海事组织（IMO）于2023年修订了其温室气体减排政策，要求到2030年将CO
2排放量减少40%，并于2050年实现航运业净零排放。在此背景下，2024年版ISO 8216:2024标准的实施允许船用燃料中生物燃料掺混比例最高可达100%的脂肪酸甲酯（FAME），取消了此前对高浓度使用FAME的限制。生物柴油具有燃烧效率高、一氧化碳排放低、硫含量低等优点，但其亲水性及易支持微生物增殖的固有风险可能损害燃料品质与发动机性能。传统上，控制燃料系统微生物增殖主要依赖异噻唑啉酮类、吗啉类及噁唑啉类等商业杀菌剂，但长期使用易导致耐药菌株出现、应用成本上升及环境污染风险增加。值得关注的是，氧化降解过程与微生物代谢密切相关，抗氧化剂可能同时发挥化学稳定与微生物抑制的双重功能。然而，抗氧化剂在海洋生物柴油体系中的生化机制研究仍相对匮乏，这促使研究人员开展了此项针对AA、BA和TBHQ多功能效应的系统评估。该研究发表于《Bioresource Technology Reports》。
研究关键技术方法主要包括：采用从船用柴油储油罐采集的微生物生物膜作为接种源，构建油-水双相微宇宙模拟体系，在27°C条件下静态孵育60天；通过UV-VIS分光光度法测定脂肪酶活性，利用Promega Water-Glo
TM试剂盒及荧光计进行ATP定量分析，采用玻璃纤维滤纸真空过滤后在60°C烘干72小时测定干生物量；运用Illumina NextSeq 2000平台对16S rRNA基因V3-V4区及ITS1区进行扩增子测序（2 × 300 bp配对末端测序），经由QIIME 2软件进行生物信息学分析；油相分析采用配备金刚石晶体衰减全反射（ATR）附件的Agilent FTIR Cary 630光谱仪，以及配备SH-Rtx-5MS毛细管柱的Shimadzu GC–MS系统进行成分分析，并通过Rancimat仪测定氧化安定性。
关于抑制潜力筛选，研究人员以从储油生物膜中分离的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为指示菌株，在补充葡萄糖的Bushnell-Haas最低培养基中对八种抗氧化剂进行36小时生长动力学筛选。结果显示，1000 mg·L
?1浓度下BA、AA和TBHQ对铜绿假单胞菌生长曲线延迟效果最为显著，而单宁酸、咖啡酸及三种植物提取物效果相对较弱。该筛选基于铜绿假单胞菌在燃料储罐中的普遍存在性及其鼠李糖脂生物表面活性剂产生能力，但后续宏基因组分析证实该菌并非实际降解群落的优势种，仅作为实用的模式生物用于初筛。
关于水相酶学活性，研究人员通过p-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）水解法每两周监测脂肪酶活性变化。结果显示，第45天时对照组脂肪酶活性高达9.906 U·mL
?1，而BA、AA和TBHQ处理组分别降至2.917、3.856和4.295 U·mL
?1，降幅显著；但第60天时各处理组间差异不再显著，提示抗氧化剂的抑制效应可能随时间延长而减弱。该结果与Harris和Cuppett（1991）报道的TBHQ在低浓度下即可显著抑制假单胞菌脂肪酶活性的研究结论相吻合。
关于ATP定量分析，第30天检测显示所有处理组细胞ATP（cATP）水平均低于对照组（142.1 ± 14.14 pg·mL
?1），其中TBHQ（19.45 ± 0.07 pg·mL
?1）和AA（33.35 ± 0.35 pg·mL
?1）抑制效果最强，BA效果略弱（61.6 pg·mL
?1）；至第60天时仅TBHQ处理组仍保持显著抑制效果，表明TBHQ提供更持久的保护。该结果与Dodos等（2017）报道的TBHQ氧化产物叔丁基苯醌（TBBQ）为实际抗菌活性分子的机制研究一致。
关于干生物量测定，第60天结果显示对照组油水界面处生物膜积累量达211 ± 21.21 mg，TBHQ处理组降至106 ± 18.38 mg，AA处理组为143 ± 34 mg，而BA处理组降低幅度相对较小。研究人员指出，TBHQ和AA处理组湿生物量外观虽较丰满，但经72小时干燥后实际干物质含量显著降低，暗示抗氧化剂可能干扰了微生物的代谢产胞外聚合物能力或改变了生物膜结构特性。
关于宏基因组分析，结果表明对照组以酵母菌Meyerozyma guilliermondii主导的Saccharomycetes纲占优（61.69%）；AA处理显著降低了酵母菌比例，转而选择性地富集了丝状真菌Curvularia属（Dothideomycetes纲，37.4%）和Fonsecaea minima（Eurotiomycetes纲，8.9%）；TBHQ处理则表现出最强的生物量减少效应，残存群落中Eurotiomycetes纲占比超过50%，几乎全部为耐逆性强的暗色真菌Rhinocladiella similis；BA处理虽维持了相对较高的M. guilliermondii比例（52.12%），但也检测到Malasseziomycetes和Agaricomycetes等担子菌门成员，显示其选择压力较为温和。细菌群落方面，对照组以Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia属（约31%）为主；AA处理组Enterobacter属和Burkholderia属各约占17-18%；BA处理组选择富集Ralstonia属（约17%）及未分类的Comamonadaceae科成员（约18%）；TBHQ处理组Burkholderia属占比高达约41%，显示该属对TBHQ具有显著耐受性。Pseudomonas属在所有处理组中均未检出，与初筛结果一致，证实了抗氧化剂的有效性。
关于油相FTIR分析，研究人员对第15、30、45和60天样品进行持续监测，重点关注1740-1750 cm
?1（C=O伸缩振动，酮、醛、羧酸等氧化产物）、3400-3600 cm
?1（O-H伸缩，超氧化物形成）、1650 cm
?1（C=C双键减少）及1100-1200 cm
?1（C-O伸缩）等关键区域。通过UMAP降维可视化及欧氏距离热图分析，发现AA和TBHQ处理组与对照组保持显著分离，表明这两种抗氧化剂有效保护了燃料的化学结构；而BA处理组在第60天时与对照组距离较近，提示其保护效果相对较弱。该分析方法借鉴了Azma等（2026）关于非线性高维环境数据建模的近期研究思路。
关于GC–MS成分分析，研究人员采用多种组成比值和指数评估降解模式。轻/重组分比值（C7–C20）/（C22–C31）显示对照组为5.776，而TBHQ（6.079）、AA（6.228）和BA（6.110）处理组均有所提高，表明抗氧化剂有助于稳定中等链长化合物。不饱和FAME保护指标（C18:2Me + C18:1Me）/（C12–C20）在对照组为1.937，TBHQ、AA和BA处理组分别升至2.300、2.171和2.301，显示抗氧化剂对烯酸甲酯的保护作用。关键比值C18:2Me/C18:1Me在对照组最低（1.557），而BA处理组最高（1.854），表明BA对亚油酸甲酯（C18:2Me）的保护效果最为突出，减缓了多不饱和酯相对于单不饱和酯的选择性降解。饱和/不饱和FAME比值及单/二不饱和FAME比值的变化趋势进一步支持了上述结论。这些化学指标与脂肪酶活性降低数据相互印证，揭示了抗氧化剂通过抑制微生物酶活性和/或直接阻断自动氧化途径来保护燃料组分的双重机制。
关于处理混合物的理化特性分析（表2），所有抗氧化剂处理组的黏度（5.303–5.393 mm
2·s
?1）均低于对照组（5.680 mm
2·s
?1），其中TBHQ效果最佳。含水量方面，BA（195.87 ± 36.5 mg·L
?1）和TBHQ（285.70 ± 58.5 mg·L
?1）显著低于对照组（374.42 ± 69.90 mg·L
?1），表明这两种化合物有助于降低燃料吸湿性。酸值指标中，BA（0.054 ± 0.03 mg KOH·g
?1）和TBHQ（0.118 ± 0.086 mg KOH·g
?1）显著低于对照组（0.242 ± 0.039 mg KOH·g
?1），亦符合氧化安定性改善的预期。表面张力在各处理间无显著差异（约38.5–39.6 mN·m
?1），可能与实验周期较长、生物表面活性剂产生时间窗口已过或存活菌群产表面活性剂能力差异有关。氧化安定性测试显示对照组诱导期仅6.2小时，而所有抗氧化剂处理组均超过48小时，远高于生物柴油最低6小时的要求标准，其中TBHQ表现最为突出。
讨论部分的核心议题围绕抗氧化剂的多功能机制及生态选择效应展开。研究人员指出，TBHQ通过其氧化产物TBBQ发挥强效生物杀灭作用，但同时选择出高度耐药的R. similis，该菌以黑色素化和胞外聚合物产生能力著称，可能带来长期生物膜形成风险；AA作为金属螯合剂和还原剂，降低了环境氧化应激，却意外促进了丝状真菌的竞争优势，引发从酵母主导向丝状真菌主导的群落演替；BA虽抗菌效果持续时间较短且生物量减少幅度较小，但其对群落结构的选择性压力最为温和，保留了较高的微生物多样性。这些发现提示，在实际应用中需权衡即时抗菌效果与长期生态稳定性之间的关系。此外，研究还强调了ISO 8216:2024标准更新后，高FAME船用燃料面临的储存稳定性挑战更为严峻，而抗氧化剂作为兼具化学稳定与微生物控制功能的多效添加剂，可为解决这一行业难题提供技术路径。
研究结论部分原文指出：该研究评估了AA、BA和TBHQ在模拟储存期间增强船用B20柴油化学稳定性并抑制微生物活性的多重作用，回应了ISO 8216:2024近期监管变化允许生物柴油最高掺混至100%的背景需求。三种化合物均显著降低了微生物污染水平，45天内脂肪酶活性由对照组的9.906 U·mL
?1降至处理组的2.917–4.295 U·mL
?1，30天后ATP水平由对照组的142.1 pg·mL
?1降至19.45–61.6 pg·mL
?1。TBHQ和AA在60天后使干生物量积累较对照组减少约50%。GC–MS分析揭示所有抗氧化剂均保护了燃料组成，提高了（C7–C20）/（C22–C31）比值及（C18:2Me + C18:1Me）/（C12–C20）比值，表明对轻质烃组分和未饱和FAME的保护作用。BA在C18:2Me相对于C18:1Me的保护方面表现最强（1.854 vs 对照组1.556）。理化分析证实处理燃料较未处理对照维持了更低的酸度、黏度和含水量。该研究首次证明了AA和BA作为海洋生物柴油混合物微生物控制剂的双重功能，以及TBHQ这一已确立作用的化合物。这些发现支持它们作为高FAME船用燃料体系多功能稳定添加剂的潜在应用，有助于燃料品质保持和操作可靠性提升。
