《Current Opinion in Toxicology》：Identifying the Gaps and Opportunities for NAMs Application in Regulatory Toxicology
编辑推荐：
当前化学品（包括化妆品和食品中的化学物质）及药物制剂数量的持续增长，对传统基于动物的危害识别（hazard identification）和风险评估（risk assessment）方法构成了挑战。新型方法学（NAMs）为提高监管毒理学效率、减少动物使用并增强
当前化学品（包括化妆品和食品中的化学物质）及药物制剂数量的持续增长，对传统基于动物的危害识别（hazard identification）和风险评估（risk assessment）方法构成了挑战。新型方法学（NAMs）为提高监管毒理学效率、减少动物使用并增强人类相关性提供了有前景的替代方案。本研究综合专家讨论和近期文献见解，以识别NAMs应用的空缺与机遇。研究人员概述了NAMs的演进历程，强调使用情境（context of use）、机制理解（mechanistic understanding）和可重复性的重要性。当前NAMs的应用涵盖皮肤和眼刺激、致敏作用、遗传毒性及内分泌活性，而全身毒性、生殖毒性和发育毒性仍有待解决。更广泛实施的主要障碍包括复杂生理学复制的技术局限性、标准化方案的缺乏，以及向人类结局进行定量外推的挑战。微生理系统（MPS）、器官芯片模型（organ-on-chip models）和人工智能（AI）框架等新兴技术有望弥补这些空缺，但需严格的质量控制和协调统一的验证标准。监管接受度受限于术语不一致、对预测能力信心不足以及资格确认研究的资源约束。研究人员提出一个统一框架，聚焦于使用情境、性能标准、生物学变异性和可重复性，以促进NAMs融入监管决策。开发者、监管机构和利益相关方之间的协作对于推进NAMs成为下一代风险评估的可靠工具至关重要，最终支持减少动物试验的全球倡议，同时确保人类和动物安全。
**1. 引言**
监管毒理学被定义为将化学品效应理解所获得的知识应用于确保社会能够安全使用化学品而不对人类或动物健康造成不可接受风险的知识体系。鉴于已存在的大量化学品以及不断新增的可能暴露于人类环境中的化学物质，继续依赖动物试验进行危害识别、确定可接受使用水平和完成全面风险评估已不现实，因其存在数量需求大、成本高、伦理问题以及生理学差异等局限性。因此，新型方法学（NAMs）在大规模评估、评估结果组织以及相似化学品信息应用方面具有重要前景。本研究基于2025年欧洲毒理学大会（Eurotox Congress）圆桌会议"NAMs与动物模型在监管科学中的进展"的专家讨论，聚焦于识别NAMs开发、应用中的挑战与机遇，涵盖美国联邦食品、药品和化妆品法案（FDCA）、有毒物质控制法案（TSCA）以及欧盟化学品注册、评估、许可和限制法规（REACH）等多元监管框架。
**2. 超越NAM(e)：演进与进展**
讨论的一个重要主题是不拘泥于NAMs定义本身的共识，而是聚焦于采纳3R原则（替代replacement、减少reduction、优化refinement）、获取尽可能多的相关化学品信息以支持危害识别和风险评估，并利用这些信息保护动物和人类健康。NAMs涵盖单层细胞或三维细胞模型（类器官或MPS）的体外试验、计算机模拟（定量构效关系QSAR、预测建模、AI）、交叉读数（read across）以及非哺乳动物模型（斑马鱼幼虫、秀丽隐杆线虫）。成功应用NAMs的关键在于构建明确的使用情境（context of use）：NAMs应针对特定科学问题，尤其是具有明确机制理解或可在体外重建毒性关键特征的终点。值得注意的是，不同实体对"验证"（validation）的界定标准存在差异——验证是确保试验严谨且可重复地回答预期问题的必要过程。
**3. 替代动物模型的NAMs实例**
大量NAMs已在监管风险评估中获得认可。皮肤腐蚀与刺激、眼刺激等终点已被多国监管机构认为可由NAMs充分覆盖，无需动物试验数据。经济合作与发展组织（OECD）定义的皮肤致敏方法学（OECD TG 497）已大幅减少了该终点的动物研究需求。对于遗传毒性，若体外试验明确显示无遗传毒性潜力，多数监管机构亦不再要求额外的体内研究。内分泌活性识别以及吸收、分布、代谢和排泄（ADME）也是NAMs开始产生重要影响的领域。
然而，导致靶器官损伤的全身毒性、神经毒性、生殖或发育毒性以及癌症发生等终点，仍然是NAMs覆盖不足的薄弱环节。核心挑战在于，NAMs无法孤立地预测重复和长期暴露后的顶端不良结局（apical adverse outcomes），或需要复杂系统相互作用才能显现毒性的情形（如血液动力学效应导致的毒性）。
**4. NAMs向人体外推的障碍**
NAMs的应用可分为危害识别和风险评估两个层面。目前NAMs成功应用于药物发现阶段的体外筛选（如药物性肝损伤DILI预测、心脏离子通道效应评估），但这些多作为监管提交的补充材料。风险评估需要将体外测量定量外推至人体体内情境，这对早期临床试验的NAMs决策尤为关键，因为需要全面评估全身毒性风险以设定安全的起始剂量和剂量递增水平。
使用人体细胞的优势在于无需跨物种外推，但需考虑多种因素以模拟所有易感人群。不同细胞类型（包括细胞性别）可能需要在三维关系中相互作用以提供对完整人体的预测。细胞培养环境，包括细胞类型来源、维持分化状态所需的特殊培养基（生长因子、细胞因子、激素等）以及三维构型，均可影响结局指标。纳入多种细胞类型和细胞层或支架已被证明是细胞功能的重要变量。统计可靠性方面，Lin等（2023）结合高通量人诱导多能干细胞（iPSC）-心肌细胞（CM）检测与计算机数据分析，证明该体外-计算机方法能以与低通量方法相当的准确性和精密度预测致心律失常潜力，且使用供体群体的浓度-反应数据优于单一供体的多重重复。
人工智能（AI）可为增强体外-体内外推（IVIVE）提供框架，以机制为基础的毒性评价为目标。将多个MPS连接起来模拟完整人体芯片（human-on-a-chip）具有可能性，但挑战在于每种器官类型需要其专门的培养基，同时又要连接以复制人体循环系统。更复杂的体外模型（如类器官和MPS）由于复杂性面临可重复性挑战，可能需要精确控制多种细胞类型及其比例，以及复杂的组装和预处理程序。
Mohapatra等（2025）提出体外方法报告的核心原则，强调每个细胞模型或试验系统具有独特特征，研究者有责任充分适应和报告这些原则。其提出的NAMs接受标准包括评估新方法的相关性和可靠性、与人体健康相关研究的一致性，以及系统评估新方法的需求。对于细胞体外模型，系统方法可涉及细胞系验证（短串联重复序列分析、确认无支原体污染、避免使用异种培养成分）、培养条件和维护程序记录（传代次数、密度、换液频率）等质量控制措施。
人胚胎干细胞和iPSC有望克服传统细胞系的局限，但带来其自身挑战，需要专门的质量控制措施：分化效率可能因批次而异，延长培养期增加污染风险和遗传不稳定性。解决措施包括实施质量控制措施、采用标准化报告指南、将质量评估纳入资金和出版决策，以及开发良好细胞培养规范（good cell culture practices）培训项目。整合质量标准（如自动化培养系统、标准化方案和试剂制备、培养条件实时监测、污染检测、AI辅助质量控制）可部分解决这些局限。
科学和技术障碍涵盖多个方面：难以捕捉人类生理和毒理学复杂性（需要多器官间的相互作用和交换）、无法将所有关键特征纳入模型以重建特定机体/毒性机制、缺乏适当的代谢和转运蛋白活性以恰当捕捉ADME特征、以及体外模型寿命不足以重现人类慢性用药等。此外，纳入各种微生物组（如肠道或皮肤芯片中的微生物组）乃至常见寄生虫可能使模型与人类的相关性更高。
**5. 超越人体外推：其他障碍**
更广泛而言，NAMs在监管决策中应用的挑战包括：监管机构对NAMs熟悉度有限、对准确性和预测能力（敏感性sensitivity和特异性specificity）缺乏信心、验证要求的不确定性（不同辖区术语差异本身即为挑战）、验证研究资金有限或缺乏、以及全球协调标准的缺位。伦理考量方面，需确保供体已提供细胞使用和用途的许可。
尽管存在验证框架和建议（如OECD、欧洲参考实验室欧洲动物试验替代方法验证中心ECVAM、机构间动物试验替代、优化和验证协调委员会ICCVAM），但此类研究耗时且昂贵，资金缺乏是重要障碍。良好实验室规范（GLP）标准的适用性亦需考虑；虽非所有NAMs均需GLP，但证明模型适用于特定使用情境的最低标准和透明度、充分且合理的实验条件和对照、性能标准、参考数据集（包括参考测试化合物的选择和数量）以及明确界定的适用域（applicability domain）对于建立对NAMs衍生数据的信心至关重要。
定量结局指标对NAMs的整体成功至关重要，应反映人体状况并与循证医学和监管实践相关。这些指标应再现组织的原位正常功能，与机制理解一致，并使用广泛接受的标准程序。模型系统需要反映疾病状态或发育阶段，以便在临床相关暴露范围内提供有效预测。相互认可的阳性和阴性测试试剂有助于确定功能状态和可重复性，并确认模型系统的适用域。多中心试验对于确认可重复性和在不同环境中执行试验的能力是必要的。
**6. NAMs监管应用的当前工作**
为确保NAMs应用与当前动物安全研究程序具有可比性，需应用相似原则以确保可重复性和再现性。Ouedraogo等提出的统一框架包含四个要点：确立使用情境（明确NAMs能做什么和不能做什么）、提供任何NAM的标准、定义或表征生物学变异性、以及证明可重复性和再现性。该框架的每个部分均可应用系统方法，如细胞系验证分析应在细胞使用时报告，无论NAMs用于监管决策还是机制研究。
多个关键区域的监管机构已发布NAMs更大规模使用和实施的路线图，反映了减少和逐步淘汰动物使用的承诺。支持机制包括安全港和数据共享提案，以及创新科学技术促进新药方法（ISTAND）计划为NAMs开发者提供反馈和建议。在欧洲，欧盟参考实验室欧洲动物试验替代方法验证中心监管相关性初步评估网络（EURL ECVAM PARERE）的作用是为NAMs及基于NAMs的测试策略的潜在监管相关性和适用性提供意见。
不断扩展的药物制剂范围为NAMs带来挑战和机遇。小分子药物和化学品具有较高脱靶效应概率，可能结合多种底物（蛋白质、DNA、RNA），开发和应用体外试验覆盖所有潜在风险更具挑战性；而生物治疗药物对其人类靶点具有高特异性，不良反应源于靶向药理学效应的夸大。这为创新方法开辟了道路。Beilmann等收集的生物治疗药物案例表明，体外NAMs可支持安全性评估并进入临床研究，证明仅使用体外NAMs即可进行有意义的安全性评估。
美国食品药品监督管理局（FDA）下属药品评价与研究中心（CDER）新药办公室（OND）近期展示了提交至机构的NAMs数据案例研究，讨论了考量因素、局限性以及数据的最终使用方式。这是研究人员理解NAMs衍生数据监管接受要求的重要资源。针对美国国立卫生研究院（NIH）和FDA的NAMs验证标准已有建议。为增强AI和机器学习（ML）技术的有效和高效使用，Tong等提出TRIAL框架（透明性transparency、可重复性reproducibility、可解释性interpretability、适用性applicability和责任liability），近期又扩展为TREAT原则（可信性trustworthiness、可重复性reproducibility、可解释性explainability、适用性applicability和透明性transparency）。
**7. 结论**
NAMs在监管毒理学中的采用提供了减少动物试验和提高人类相关性的变革性机遇，但实施仍复杂。虽然NAMs在皮肤刺激、致敏和遗传毒性等终点获得进展，全身毒性和慢性毒性以及神经毒性、发育和生殖毒性方面仍存在显著空缺。科学挑战包括复制人体生理复杂性、确保机制相关性、以及实现从体外到体内条件的稳健定量外推。技术障碍如类器官和MPS等先进模型的可重复性、方案标准化和质量控制进一步复杂化进展。监管挑战同样关键：对NAMs熟悉有限、全球协调不足、资格确认和接受标准不确定、以及辖区间术语不一致阻碍信心和采纳。资源约束（包括验证研究资金和多中心可重复性试验需求）增加负担。供体细胞使用的伦理考量和细胞来源变异性等实际问题也需解决。AI驱动建模和集成人体芯片系统等新兴技术有望克服当前局限，但需要严格验证和治理。最终，NAMs应整合入证据权重（WoE）方法，与3R原则保持一致，推动监管科学向更高效率、伦理责任和人类（及动物）健康保护发展。成功与否取决于监管者、产业和学术界之间的协作，以建立明确的使用情境、协调统一的接受框架和透明的性能标准。重大障碍在于NAMs（无论是单一试验还是试验组合）并非重复剂量动物观察研究（如亚慢性毒性研究）的1:1替代，而需要纳入更具机制性、假设驱动的框架，以解决毒性关键特征并考虑使用情境。
