Platinum TALEN介导的非病毒基因编辑技术促进了临床规模下癌症抗原反应性T细胞的制备

《Cytotherapy》：Platinum TALEN-mediated nonviral gene editing facilitates clinical-scale production of cancer antigen-reactive T cells

　　

作者：土师川嘉男（Kayo Toishigawa）、Magoori Kenta、Sato Hiroyuki、Edahiro Taro、Ureshino Hiroshi、Shindo Takero、Suzuki Ryuji、Sakuma Tetsushi、Yamamoto Takashi、Okada Morihito、Ichinohe Tatsuo

日本广岛大学放射生物学与医学研究所血液学与肿瘤学系

摘要

近年来，靶向基因组编辑技术已成为开发设计性细胞产品的下一代工具。尽管Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9（CRISPR-Cas9）是最常用于治疗性基因组编辑的核酸酶，但其广泛应用仍受到潜在脱靶效应和高专利费用的阻碍。Platinum TALEN是一种经过改良的TALEN，具有非重复可变二残基（non-RVD）变异，比缺乏非RVD变异的传统TALEN具有更高的效率。在本研究中，我们使用Platinum TALEN靶向T细胞受体（TCR）基因位点，并结合单链DNA同源定向修复（HDR）模板，旨在生成能够识别癌抗原并杀死癌细胞的TCR改造人类T细胞。该系统可在临床规模上利用约50毫升的外周血可重复生产TCR工程化T细胞。经过基因组编辑的T细胞在CD4+和CD8+亚群中均保留了幼稚/类幼稚及记忆表型，并在体外对癌细胞表现出高效的细胞毒性。总之，Platinum TALEN介导的非病毒基因组编辑技术有助于将内源性TCR替换为所需的TCR，可应用于治疗性T细胞产品的临床制造。

引言

基因组编辑是一项新兴技术，可实现设计性细胞疗法的开发。在过去十年中，已使用三种主要的人工核酸酶——锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）和Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9（CRISPR-Cas9）进行了多项关键临床试验，旨在治疗难治性病毒感染或恶性肿瘤[[1], [2], [3]]。此外，利用CRISPR-Cas9对遗传性红细胞疾病（严重镰状细胞病和输血依赖型β-地中海贫血）进行细胞基因治疗已取得成功，并已在英国和美国获得批准，尽管基因组编辑后原代人类细胞的长期安全性尚未明确[[4]]。

基于细胞的疗法中最活跃的领域之一是移植经过基因改造的免疫效应细胞，这些细胞能够靶向并裂解恶性细胞。特别是，携带嵌合抗原受体（CAR-T）的基因改造T细胞已应用于实际临床实践，并实现了对先前难治性血液系统恶性肿瘤的持久控制[[5]]。人类抗原特异性T细胞受体（TCR）是由14号染色体上的TRA基因编码的α链（TCRα）和7号染色体上的TRB基因编码的β链（TCRβ）组成的异二聚体。众所周知，TRA和TRB基因通过基因重组可产生极其多样的TCR，数量估计在10⁶到10⁸个克隆之间。大量研究表明，其中一些TCR能够特异性识别恶性肿瘤中表达的抗原。因此，除了CAR-T细胞外，表达针对肿瘤特异性抗原的T细胞受体（TCR-T）也是治疗恶性肿瘤的另一种工具。尽管小规模临床实验显示出巨大潜力[[6], [7], [8], [9]]，但在制造携带外源TCR的T细胞时仍存在诸多挑战，因为据报道转导的TCR与内源性TCR之间的竞争会降低所需TCR的表达[[10]]。此外，还可能出现意外的组合（如外源α链与内源性β链或内源性α链与外源β链的配对）。这些因素可能导致抗原特异性降低以及预临床模型中的移植物抗宿主病样并发症[[11]]。此外，广泛用于TCR转导的重组病毒载体的稳定生产是一个耗时且劳动密集的过程，尽管针对纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）抗原的TCR-T已在美国获得批准[[12]]。相比之下，利用基因组编辑技术生产新的TCR转导T细胞具有多项优势。通过基因敲除内源性TCR基因（即14号染色体上的TRA和7号染色体上的TRB），可以更有效地将内源性TCR替换为所需的TCR[[13,14]]。此外，通过共转染基因编辑器和同源定向修复（HDR）转基因模板，可以在非病毒方式下将新的TCR编码基因 cassette插入TCR位点[[15], [16], [17]]。仅切割编码TCRα恒定区（TRAC）的序列可以防止内源性α链的表达，但内源性β链仍然存在。因此，无法避免外源α链与内源性β链之间的错误配对。相反，如果同时切割TRAC和TCRβ恒定区基因（TRBC1和TRBC2），则可以完全去除内源性TCR。理论上，这样只会表达由转导的α链和β链组成的TCR，从而几乎消除错误配对的TCR表达。

TALEN作为CRISPR-Cas9系统的替代方案，是临床靶向基因组编辑的理想工具[[18,19]]。定制的TALEN单体包含Fok I内切酶结构域和来自Xanthomonas细菌分泌的转录激活因子样效应因子（TALEs）的DNA结合结构域。这些TALE重复序列在第12和第13位含有两个独特的氨基酸残基，作为“蛋白质-DNA代码”，每个残基都能与DNA的一个碱基结合。与RNA引导的CRISPR-Cas9系统相比，TALEN在脱靶活性方面概念上更为可靠，因为TALEN介导的基因破坏需要一对TALEN（即左侧和右侧的TALEN）在接近的位置结合，以使Fok I结构域二聚化并诱导目标序列的双链断裂。事实上，先前的研究显示使用TALEN未检测到脱靶位点，而一些CRISPR-Cas9目标则出现了可检测到的整合酶缺陷慢病毒载体的脱靶整合[[20]]。我们团队此前发现，具有非重复可变二残基（non-RVD）变异的周期性TALE重复序列的Platinum TALEN比传统TALEN具有更高的活性[[21]]。Platinum TALEN可有效修饰哺乳动物体细胞中的基因，因此可用于临床使用的细胞产品的制造[[22]]。

在本研究中，我们选择NY-ESO-1作为模型癌相关抗原[[23,24]]，并使用原始的1G4-TCR克隆作为癌反应性TCR的原型[[25]]。1G4是一种针对NY-ESO-1的肽反应性TCR，具有HLA-A*02:01限制性，其亲和力增强的变体已在多项临床试验中使用，证明了其对实体瘤和多发性骨髓瘤的有效性[[7], [8], [9]]。本文展示了使用高效Platinum TALEN靶向TCR位点并结合单链HDR TCR模板，从外周血中大规模生产1G4介导的NY-ESO-1反应性TCR-T的可行性。所产生的TCR-T保留了幼稚/类幼稚和记忆表型亚群，并能在体外有效裂解表达HLA-A*02:01的NY-ESO-1癌细胞系。

章节片段

抗体

本研究中使用的荧光标记的小鼠单克隆抗人T细胞抗原抗体列在补充表S1中。为了分析基因组编辑和未编辑的人类原代T细胞的TCR Vβ链表达谱，我们使用了IO Test Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit（Beckman Coulter Immunotech，法国马赛），该试剂盒包含八瓶荧光异硫氰酸酯（FITC）和/或藻红蛋白（PE）标记的抗体，每瓶包含三种TCR抗体的混合物

Platinum TALEN靶向TRAC和TRBC位点的效率

我们首先通过电穿孔将针对TRAC和TRBC位点的Platinum TALEN mRNA导入Jurkat细胞中，通过产生的CD3阴性细胞比例（TRAC-TALEN约为80%，TRBC-TALEN约为60%）确认了其有效的基因敲除效果。为了确定这些TALEN的特异性，我们对目标位点和补充表S3中列出的39个潜在脱靶位点进行了扩增子测序

讨论

本研究旨在通过使用长单链1G4 DNA模板（约4.8 kbp）和Platinum TALEN介导的非病毒基因组编辑，将内源性TCR替换为1G4-TCR，从而产生能够特异性识别HLA-A*02:01限制的NY-ESO-1来源抗原的T细胞（图8）。制造的1G4-TCR表达T细胞具有功能性，能有效裂解目标癌细胞系。因此，Platinum TALEN似乎是一种有用的基因组编辑工具，值得进一步研究

伦理声明

本手稿中描述的所有实验均获得了Repertoire Genesis Inc.和广岛大学伦理审查委员会的批准和授权（批准编号分别为E2014-9127、E2018-9221和E2023-0108）。

作者贡献

TI和RS设计了本研究，KT、MK、HS和TI起草了原始手稿。TSakuma和TY发明了Platinum TALEN，并设计了用于研究的TRAC/TRBC-TALEN质粒。KM、HS、TSakuma、TY和RS协助了TRAC/TRBC-TALEN mRNA的化学合成。KM、HS和TSakuma设计并协助合成了1G4-TCR ssDNA HDR模板。KT、HS和TI设计了所有电穿孔、细胞培养和流式细胞术实验。KM和HS协助了遗传学工作

资助

本研究部分得到了日本医疗研究开发机构（AMED）的资助（#19pc0101041h0001给RS）、日本文部科学省的资助（#23K07815给TI），以及广岛大学、长崎大学和福岛医科大学联合使用的放射灾害医学科学网络型研究中心的资助（给MO和TI）。