《Food Hydrocolloids》：Bio-based pH-Responsive Double Emulsions with Controllable Stability for Enhanced Oral Delivery of Probiotics
编辑推荐：
益生菌在人类健康中扮演着重要角色，但其最终在肠道中的存活率往往因许多苛刻的生存条件而受限。双重乳液因其液态环境和区室化微观结构，是活体益生菌包埋与保护的首选。在此，研究人员报告了一种pH响应的水包油包水（W1/O/W2）双重乳液，通过两步法制备，用于增强益生菌
益生菌在人类健康中扮演着重要角色，但其最终在肠道中的存活率往往因许多苛刻的生存条件而受限。双重乳液因其液态环境和区室化微观结构，是活体益生菌包埋与保护的首选。在此，研究人员报告了一种pH响应的水包油包水（W1/O/W2）双重乳液，通过两步法制备，用于增强益生菌的口服递送。在外部水相中，酪蛋白酸钠（NaCas）和海藻酸钠（SA）作为协同的食品级稳定剂。NaCas提供界面活性，而SA增加了连续相的粘度并赋予了剪切稀化行为，这促进了乳化并在储存期间抑制了液滴迁移。此外，NaCas–SA混合物形成了比单独NaCas更柔软、更具耗散性的界面膜，减少了液滴聚并。重要的是，该系统表现出双重pH响应行为。在酸性胃条件下，它经历快速的在原位凝胶化，其中SA与NaCas之间的强络合作用强化了水凝胶网络，并牢固地固定了双重乳液液滴。相反，当转移到碱性肠道条件时，网络解体，导致水凝胶溶解和渐进的液滴崩解，以实现可控的益生菌释放。体外模拟消化证实了保护效率。未包埋的益生菌显示出大量的活力损失，而传统的仅含NaCas的乳液提供的保护有限。相比之下，pH响应的NaCas–SA双重乳液以最小的损失保留了益生菌活力。因此，这些发现使该系统成为一种前景广阔的pH响应平台，用于高效的肠道靶向益生菌递送。
论文解读：基于生物材料的pH响应型双重乳液增强益生菌口服递送
益生菌因其多样的健康益处而受到越来越多的关注，它们是活的微生物，当摄入足够量时，可赋予宿主益处，主要作用是调节肠道微生物群和支持微生物平衡。除了消化健康，越来越多的证据表明益生菌可以通过肠-脑轴影响系统生理学，与代谢、免疫和心理健康障碍相关。然而，在处理和胃肠道转运过程中维持益生菌活力仍然具有挑战性。在处理过程中，混合和均质的剪切力以及热和干燥的氧化应激等因素会降低存活率。随后，益生菌必须经受胃肠道特别是胃的极低pH等苛刻条件，这进一步限制了到靶点的递送。因此，开发有效的递送系统以保护益生菌并保持其活力至关重要。
现有的益生菌包埋策略，如带有保护剂的喷雾干燥、水凝胶珠和单细胞涂层，可能受限于复杂的制造、高成本以及制备过程中显著的活力损失。乳液系统是一个引人注目的替代方案，因为它们可以在温和条件下制备并容易掺入液体或半固体食物中。然而，简单的水包油（W/O）乳液仅提供适度的保护，且化学惰性的油相难以设计控释机制。相比之下，水包油包水（W1/O/W2）双重乳液（DE）提供了优越的层级屏障。益生菌保护在内水相中，由中间油层屏蔽，外部水相可以用特定材料设计用于在胃肠道中进行触发和靶向递送。尽管DE在益生菌包埋方面具有明显优势，但大多数先前的研究主要集中在改善乳液稳定性和基本保护上。因此，进一步开发具有pH响应性和可控稳定性的食品级DE系统对于增强益生菌保护和靶向释放仍然很重要。最近的研究表明，蛋白质-多糖组合可以改善负载益生菌的DE系统的稳定性和胃肠道保护。然而，生物聚合物配对在调节界面行为和酸诱导微观结构转变中的作用仍知之甚少，这限制了用于位点特异性肠道递送的DE系统的合理设计。
在这项研究中，研究人员研究了一种pH响应的W1/O/W2双重乳液，具有可控稳定性，通过两步乳化方法由酪蛋白酸钠（NaCas）和海藻酸钠（SA）共稳定。虽然NaCas表现出优异的乳化能力，但NaCas稳定的乳液通常显示出有限的稳定性以及对pH等环境条件的敏感性。相比之下，SA可以通过酸诱导凝胶化赋予乳液pH响应性，但其界面活性不足以单独稳定乳液，并且由此产生的酸诱导凝胶通常表现出有限的机械强度，这可能限制其在胃条件下的保护能力。为了解决这些限制，研究人员构建了一个基于生物材料的双重乳液系统，利用NaCas和SA的互补作用。在该系统中，NaCas提供界面活性，而SA有助于酸诱导凝胶化并进一步增强乳液稳定性。所得系统旨在胃条件下进行原位凝胶化，随后在肠道条件下溶解，从而实现包埋益生菌的保护和控释。为了进一步阐明稳定机制，采用带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D）探测SA如何改变界面膜的粘弹性性质，从而进一步深入了解蛋白质-多糖组合稳定双重乳液的界面机制。
该研究发表在《Food Hydrocolloids》期刊上。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：使用大肠杆菌Nissle 1917（EcN）作为模型益生菌；通过温和的预混合和手动振荡制备W1/O单乳液（内水相W1为EcN的PBS悬浮液，油相O为含PGPR的MCT），并优化水相比例；通过将初级单乳液加入含NaCas和SA的外部水相（W2）中进行二次乳化以制备W1/O/W2双重乳液，并优化初级乳液体积分数；利用光学显微镜和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察乳液形态及益生菌定位与活力；测量连续相的表观粘度和油-水界面张力（IFT）；使用QCM-D分析NaCas和NaCas-SA在疏水金传感器上的吸附动力学和粘弹性；通过振荡剪切流变学表征SA和NaCas-SA在模拟胃液（SGF, pH 1.5）中酸诱导凝胶的机械强度；进行体外模拟消化（先后经SGF和模拟肠液SIF, pH 7.2处理共4小时）并结合平板计数法（CFU/mL）评估益生菌活力。
研究结果如下：
3.1. 初级W1/O单乳液的形成与优化
研究人员首先尝试高剪切均质化制备含益生菌的单乳液，但强烈的剪切力导致不可避免的益生菌损伤。因此采用了相对温和的乳化方法（预混合后手动振荡）。系统研究了不同水分数（10%、20%、30%、40% v/v）的影响。显微镜观察显示，在10%和20%水分数下，液滴分布均匀，储存7天后几乎没有聚并迹象，稳定性良好。而较高的水分数（30%和40%）导致逐渐更大且不那么均匀的液滴，并且随时间观察到明显的液滴聚并，D[4,3]显著增大。CLSM确认了EcN细胞成功包埋在内部水相液滴内，且细胞膜完整，活力得以保持。
3.2. 由NaCas-SA二元系统制备的W1/O/W2双重乳液
在成功制备初级W1/O乳液后，通过将初级单乳液引入W2中搅拌来制备双重乳液。对照组（单独使用NaCas或SA）在仅仅3天内就出现明显的絮凝、聚并和相分离，不稳定。相反，NaCas和SA作为二元稳定剂的组合产生了更小且更稳定的乳液，表明蛋白质-多糖组合在油-水界面提供了协同稳定作用。优化了初级乳液的体积比（10%、25%、50%、75%）。含有25%初级乳液的配方在7天储存后保留了相对均匀的形态，D[4,3]仅增加12%（从49到55 μm），表现出显著的稳定性，同时兼顾了益生菌负载量，被确定为最佳选择。CLSM和光学显微镜证实了双重乳液的典型W1/O/W2结构，EcN细胞位于内部水相（W1）内并发出绿色荧光，表明活力保持，油相层将内外水相分开。
3.3. 本体流变学的影响
SA在乳液稳定性中的一个广为人知的作用是改变连续相的流变学。研究人员通过测量不同SA浓度下NaCas-SA混合物的表观粘度来评估这一点。2% w/v NaCas溶液表现出近乎牛顿行为，表观粘度非常低（约1.8 mPa·s）。加入1% w/v SA导致表观粘度显著增加（在10 s-1时约113 mPa·s）。这符合多糖主要通过增加连续相的表观粘度来增强乳液稳定性的普遍观点，高粘度抑制储存期间的液滴迁移，从而减少碰撞、聚并和乳析。此外，NaCas-SA混合物表现出明显的剪切稀化行为，这在乳化过程中有利：高剪切下表观粘度降低促进液滴破碎，剪切移除后表观粘度恢复限制液滴移动并抑制立即再聚并。因此，SA诱导的增稠和剪切稀化共同有助于NaCas-SA稳定的W1/O/W2乳液改进的动力学稳定性。
3.4. 界面性质的影响
仅通过本体相增稠减缓液滴运动并不能完全解释抗聚并性的改善，这也受界面膜的保护性质影响。界面张力（IFT）测量显示，含NaCas的双相系统的IFT在最初100秒内快速下降然后达到平衡，表明NaCas在油-水界面快速吸附。相比之下，单独SA仅显示有限的IFT降低，与其弱界面活性一致。然而，在NaCas与SA的混合物中，IFT的时间演化和平衡值与单独NaCas相似，表明NaCas主导二元系统中的界面张力响应和吸附动力学，SA未显著贡献于降低界面张力，但可能主要影响本体流变学和可能的界面层性质。QCM-D测量进一步揭示，NaCas-SA二元系统表现出比单独NaCas明显更高的耗散，表明形成了更具耗散性和粘弹性的界面层。NaCas-SA系统即使在冲洗后仍比单独NaCas表现出高得多的耗散，与更柔软和水合的界面层一致。这表明SA的掺入产生了比单独NaCas更具耗散性的界面响应，有助于抵抗液滴变形和薄膜排水，从而有助于乳液稳定性。
3.5. SA和NaCas-SA的原位酸诱导凝胶化行为
据报道SA在低pH值下表现出酸诱导凝胶化，但产生的SA凝胶通常较弱。研究人员检查了作为DE系统中外部水相的SA和NaCas-SA溶液的凝胶化过程。将SA溶液引入SGF（pH 1.5）导致原位凝胶化，产生半透明、松散且弱的凝胶。相反，NaCas-SA表现出显著更强的原位凝胶化，形成不透明的白色凝胶，看起来更具内聚性。冷冻干燥后，SA凝胶呈现塌陷的层状片，致密的低孔隙固体；而NaCas-SA凝胶转变为连续的3D多孔网络，具有微米尺度的互连孔隙。NaCas（等电点pI约4.3-4.7）在pH 1.5时因氨基质子化而带净正电荷，SA大部分质子化仅带轻微负电荷；NaCas与SA之间的分子间吸引力（主要通过氢键和有限的静电吸引）驱动形成强的不透明白色凝胶，具有更高的持水能力。
3.5.2. 酸诱导凝胶的机械强度
酸诱导凝胶的机械强度对于在胃条件下维持双重乳液的结构完整性至关重要。应变振幅扫描显示，两种系统在LVR内均表现为凝胶（G' > G''）。NaCas-SA复合凝胶的储能模量（G'）在LVR内几乎是纯SA凝胶的100倍，表明网络结构更强。此外，LVR极限的临界应变从SA凝胶的约10%扩展到NaCas-SA凝胶的约30%，表明复合凝胶网络在结构开始屈服前能承受更大的变形。频率扫描显示NaCas-SA凝胶表现出典型的固体状行为，G'比G''高一阶且基本与频率无关，表明稳定且结构良好的弹性网络；而纯SA凝胶的G'表现出强烈的频率依赖性，是较弱、结构较少的粘弹性系统的特征。
3.6. 体外模拟消化与益生菌活力
监测了W1/O/W2双重乳液在整个体外模拟消化过程中的形态演变。最初，DE系统作为稳定的均质液体存在，含有均匀的球形液滴。有趣的是，引入SGF后，乳液经历快速相变，立即形成内聚的水凝胶，包埋并固定了DE液滴。液滴在凝胶基质内变得有些变形，但结构完整性保持完整，没有显著的聚并或破裂。这种酸诱导的水凝胶屏障在胃转运过程中快速形成并持续存在，对于保护包埋的益生菌免受胃的苛刻酸性环境和机械力至关重要。随后，系统转移到SIF中再孵育2小时。在SIF的弱碱性环境（pH 7.2）中，水凝胶结构逐渐溶解，归因于环境pH显著高于NaCas的pI和SA的pKa，导致两种聚合物的羧基去质子化，产生的静电排斥 dismantled 凝胶网络。水凝胶溶解使DE液滴暴露于SIF和模拟肠道蠕动的机械搅拌中，促进了乳液的不稳定和逐渐破裂，从而导致包埋益生菌的渐进释放到肠液中。
通过平板计数法定量确认递送系统的保护功效。初始EcN活细胞计数为2.13×108CFU/mL。模拟消化后，未包埋（游离）益生菌的活力骤降至低于1.0×102CFU/mL。鲜明对比的是，包埋在NaCas-SA DE中的EcN保持了1.24×108CFU/mL的高活力，表现出极小的细胞损失和卓越的保护。这归因于双重防御机制：外部pH响应水凝胶在胃转运期间屏蔽乳液，油相提供额外的保护屏障。作为比较，缺乏pH敏感特性的对照NaCas DE也进行了评估，虽然该配方提供了部分保护，最终细胞计数为1.49×105CFU/mL，但这仍构成从初始状态近3-log的活力降低，表明仅油层的保护是不够的。
讨论与结论总结：
在这项工作中，研究人员开发了一种用于益生菌包埋和递送的食品级、pH响应的双重乳液系统。益生菌包埋在PGPR稳定的W1/O初级乳液中，随后分散到含有NaCas和SA的外部水相中以获得稳定的W1/O/W2双重乳液。在双重乳液中，NaCas通过在油-水界面快速吸附提供界面活性，而SA改善本体流变学并有助于与NaCas组合形成更柔软和更具粘弹性的界面层，这有助于抑制薄膜排水和液滴聚并，从而改善乳液稳定性。在胃pH下，SA经历酸诱导凝胶化，包埋并固定液滴，同时质子化的NaCas与SA关联以强化水凝胶网络，产生比单独SA更强的凝胶。在肠道条件下，水凝胶可逆地溶解，液滴逐渐崩解，使益生菌能够实现位点特异性释放。在体外消化过程中，这种基于生物材料的pH响应双重乳液系统比游离益生菌和传统双重乳液更好地保持了益生菌活力。鉴于温和的加工条件和基于生物材料的组件，这种双重乳液系统为开发富含益生菌的功能性食品提供了一个前景广阔的平台。
