综述：基于纳米技术的生物传感器，用于多重核酸检测

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Nanotechnology-powered biosensors for multiplex nucleic acid detection

　　

袁媛媛|刘慧琳|罗子生|杨涛|林星宇

中国浙江省杭州市浙江大学生物系统工程与食品科学学院，310058

摘要

多重核酸检测在食品安全、医学诊断和环境监测中需求日益增加，但传统的工作流程仍受限于笨重的仪器、繁琐的程序和有限的多重检测能力。本文综述了纳米材料如何通过信号生成、探针加载和反应调控、目标富集以及空间限制来支持多重核酸生物传感。随后讨论了主要的分子识别策略，包括等温扩增、CRISPR/Cas系统和Argonaute系统，并比较了主要的多重检测方法，如基于颜色、信号强度、分离、熔解曲线、形态以及其他基于信号的读出模式。文中总结了多重检测在食品安全、医学诊断、环境监测、农业疾病筛查和基因分型中的典型应用。最后概述了实现稳健且可部署的多重生物传感的关键挑战和未来发展方向。本文为设计用于“同一健康”（One-Health）应用的多重核酸生物传感平台提供了比较框架。

引言

核酸检测在从医学诊断到食品安全和环境监测的各种应用中发挥着重要作用[1]。然而，在资源有限的条件下满足即时检测（POCT）的迫切需求仍然具有挑战性。传统的核酸检测技术依赖笨重的精密仪器、劳动密集型协议和较长的周转时间，通常不适合病原体的实时监测[2]。因此，迫切需要开发新型核酸分析系统，这些系统能够在复杂现场环境中结合高灵敏度和特异性。

在涉及具有类似临床症状的共感染或成分复杂的生物样本的情况下，单目标检测方法往往效率低下且容易产生假阴性结果。为了提高诊断准确性和通量，核酸检测技术正从单重检测向多重检测格式转变[3][4]。这一转变得到了多种扩增和识别策略的支持，包括聚合酶链反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和滚环扩增（RCA），以及新兴的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）和Argonaute（Ago）系统。这些方法为敏感的目标识别和信号生成提供了分子基础。同时，纳米技术使得检测格式更快、更集成。通过利用光热加热和纳米流体限制，这些平台显著加快了反应动力学，适用于快速POCT应用[5]。因此，可视化这些扩增目标需要高效的生物传感器，能够将生物识别信息通过荧光[6]、比色[7]、电化学[8]、表面增强拉曼散射（SERS）[9]或表面等离子共振（SPR）[10]转化为可读信号。尽管取得了这些进展，构建高性能的多重检测平台在技术上仍然具有挑战性。在传统的荧光和比色检测中，增加检测通道数会导致光谱重叠和信号串扰，严重限制了编码能力。类似地，当扩展到多个目标时，侧向流动检测（LFA）等POCT设备在空间分辨率和流体控制方面也存在固有限制。

为了克服这些瓶颈，多重核酸生物传感应被视为三个相互依赖层次的协调整合。第一层是功能层，纳米材料通过其独特的物理化学性质提供信号生成和抗串扰编码、探针加载和反应调控、目标富集以及用于数字化的空间限制。第二层是识别层，等温扩增、CRISPR/Cas系统和Ago系统决定了分子特异性和信号放大的实现方式。第三层是信息分离层，多重检测最终通过光谱、强度、空间、形态或非光学编码和读出策略实现。因此，多重平台的分析性能和转化潜力取决于这三个层次之间的耦合效果。

因此，本文从材料功能出发，探讨了分子识别、多重检测策略、应用场景以及领域特定的转化挑战。首先研究了纳米材料作为信号转导体、载体、富集工具和分隔介质在多重核酸生物传感中的作用。然后比较了主要的分子识别策略，包括等温扩增、CRISPR/Cas系统和Ago系统，强调了它们的多重检测逻辑、实际优势及内在局限性。接下来分析了多重信息如何通过不同的读出策略进行编码和解码。最后在食品安全、医学诊断、环境监测、农业疾病筛查和基因分型等典型“同一健康”场景中评估了这些集成策略。最后讨论了仍在限制应用推广的领域特定障碍，包括材料标准化、试剂稳定性、样本到结果的整合、解码复杂性以及多重检测密度与实际可用性之间的权衡。本文旨在提供一个比较性和机制导向的框架，以理解纳米技术如何实现稳健且可部署的多重核酸检测平台（图1）。

章节片段

纳米材料在多重核酸检测中的功能作用

在过去几十年中，纳米技术通过利用纳米尺度（1–100 nm）出现的独特物理化学性质，显著提高了多重核酸检测的灵敏度、通量和速度[1–10]。纳米材料被广泛研究作为将核酸识别事件转换为可读信号的关键生物传感器组件[11]。与其他块状材料相比，纳米材料具有较大的表面积与体积比[12]，并且电子特性

多重核酸检测的分子识别策略

在纳米材料为多重生物传感提供功能基础后，分子识别策略决定了目标特异性和信号放大的实现方式。在多重核酸检测中，等温扩增、CRISPR/Cas系统和Ago系统代表了三种具有不同优势和限制的识别范式。等温扩增主要作为一种灵敏度策略，而CRISPR/Cas系统则具有可编程的识别能力

核酸检测的多重检测策略

在通过分子识别策略确定目标特异性后，多重核酸生物传感的关键挑战是在共享系统中分离和解析目标特异性信息。因此，多重检测不仅仅是简单地增加目标数量，而是采用能够在不同维度上编码和解析信号且串扰最小的策略。多重检测更应视为一个信息分离问题

食品安全检测

食品供应链的全球化使得监测食源性病原体、毒素和掺假行为极具挑战性。基于纳米技术的多重检测不仅提高了灵敏度，还有效克服了食物基质的严重干扰。

筛查食源性病原体是该领域的主要任务。功能化的纳米材料通过实现多种能力，正在革新食源性病原体的多重核酸检测

挑战与展望

基于纳米技术的生物传感器通过将材料功能、分子识别和信息编码链接在集成分析平台中，大大扩展了多重核酸检测的设计空间。在本综述中讨论的研究中，纳米材料不再仅仅是被动信号增强剂，还充当探针加载、目标富集、空间限制和正交读出的功能元素。尽管取得了这些进展，但核心问题

CRediT作者贡献声明

林星宇：撰写 – 审稿与编辑，监督。杨涛：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。袁媛媛：撰写 – 审稿与编辑，初始草稿准备，实验研究，概念构思。罗子生：撰写 – 审稿与编辑。刘慧琳：撰写 – 审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的利益冲突或个人关系可能影响到本文报告的工作。

数据可用性

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利益冲突声明

? 作者声明他们没有任何已知的利益冲突或个人关系可能影响到本文报告的工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32372416）和浙江省自然科学基金（编号：LRG26C200001, LMS26C200002）的支持。