综述：基于CRISPR/Cas的生物传感平台在全面食品安全监测中的应用：机制、策略与案例

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：CRISPR/Cas-based Biosensing Platforms for Comprehensive Food Safety Monitoring: Mechanisms, Strategies, and Applications

　　

刘恒|张英月|朱美玲|周一飞|李毅|陈晓萍|周虎|李颖|李涛

湖北中医药大学湖北石镇实验室实验医学学院，武汉430065，中国

摘要

食品安全监测对于保护公众健康和确保全球食品质量至关重要。由于传统检测技术依赖于集中式仪器设备且周转时间较长，它们越来越无法满足现代快速筛查的需求。因此，CRISPR技术脱颖而出，其主要优势在于操作简便、可现场部署以及响应迅速。基于这些优势，CRISPR平台的最新进展实现了单核苷酸分辨率和阿托摩尔级别的灵敏度，显示出对复杂食品安全监测场景的强大适应性。本文系统总结了用于食品安全的集成CRISPR平台，涵盖了针对多种目标的信号转导模块、信号放大和多功能读出系统。此外，我们强调了这些技术在检测危害物方面的强大应用，具有高特异性、超灵敏度和可靠性。最后，我们指出了未来的发展方向，强调了与人工智能的结合以及检测方法的标准化，这是下一代智能食品安全监测系统的关键驱动力。

引言

食品安全监测对于降低健康风险和减少污染事件的经济影响至关重要[1]。食品危害可能出现在供应链的各个环节，包括初级生产、加工、包装、运输和储存[2]。全球化的大规模分销可能会将局部食品污染迅速扩散为跨区域风险[3]。实际上，食品安全威胁主要来自两个来源：首先是微生物污染，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫；其次是非微生物污染，涉及生物毒素、农药残留、抗生素残留、重金属、转基因（GM）成分以及食品欺诈或掺假[4]。历史上，监测和事件响应更侧重于微生物危害，因为它们与急性爆发密切相关[5]。随着农业集约化、工业化加工和市场的扩大，非微生物危害变得越来越突出，需要同等关注，特别是由于它们可能导致的慢性暴露和累积健康风险[6]。此外，实际样本中混合污染的情况越来越多。这种复杂性提高了对灵敏度和分析特异性的要求[7, 8]。总体而言，这些挑战需要改进检测方法，以便及时做出决策，并在整个食品供应链中进行主动的现场监测。

传统分析方法仍然是食品安全检测和监管确认的基础。基于培养的微生物学方法被广泛认为是鉴定活病原体的参考方法，并支持后续的血清分型和抗菌药物敏感性测试[4]。核酸方法如qPCR具有高分析灵敏度，能够对已知目标进行定量分析[9]。免疫测定操作简便，适用于常规工作流程中的大规模筛查[10, 11]。对于非微生物危害，液相色谱-质谱（LC/MS）具有高准确性和化学特异性，广泛用于确认性分析[12]。尽管有这些优点，传统工作流程通常不适用于快速、分散式的监测。它们要么需要较长的周转时间，要么依赖于集中式实验室和多步骤样本处理[13, 14]。在复杂的食品基质中，抑制剂和干扰因素可能会影响检测的稳健性和重复性[15]。此外，常规监测越来越需要更高的通量和多重检测能力，这对许多传统格式来说仍然具有挑战性[16]。这些限制促使人们开发更快、更用户友好的检测策略，以支持在整个食品供应链中的及时决策和现场监测。

基于CRISPR/Cas的检测方法在食品安全监测中越来越具有吸引力，因为它们比许多传统工作流程更能满足快速和分散式检测的实际需求（表1）[17]。这些方法可以通过简化的程序和最少的仪器设备实施，从而便于现场筛查和缩短周转时间[18]。通过可编程引导RNA（gRNA）实现高分析特异性，并通过将目标识别与Cas介导的信号放大相结合来获得高灵敏度。从机制上讲，Cas12和Cas13等酶通过报告分子的伴随切割将序列特异性结合转化为强烈的信号[19, 20]。这种模块化设计适用于检测超低丰度目标时的等温扩增，同时也支持荧光、侧向流动和电化学信号等便携式读出格式[21]。在食品安全应用中，基于CRISPR的检测方法已被广泛用于快速检测食源性微生物，并逐渐扩展到非微生物危害[22]。许多这些分析物不是核酸，无法直接通过crRNA在其天然形式下进行检测。这推动了分子转导接口的发展，如适配体和DNA酶，将目标识别转化为核酸触发器以激活Cas介导的信号生成[23]。总体而言，CRISPR识别和读出的模块化特性为构建快速、灵敏且可部署的检测方法提供了连贯的框架，从而支持对多种食品基质的全面监测。

尽管取得了快速进展，但将基于CRISPR的方法转化为常规食品安全监测仍然具有挑战性。复杂的食品基质和可变的样本预处理可能会影响检测性能[24]。在现场使用中，稳健性、污染控制和试剂稳定性至关重要[25]。在紧凑和用户友好的格式中，多重检测和定量也仍然困难[26]。这些实际限制促使我们系统地总结了食品安全背景下的设计策略和应用证据。在这篇综述中，我们总结了CRISPR/Cas在食品安全监测方面的最新进展，并强调了集成设计原则（图1）。我们首先通过将CRISPR检测方法组织成功能模块和集成工作流程来综合平台级设计，包括目标识别和转导、信号放大策略以及支持便携式读出的多种输出模式。然后，我们总结了涵盖微生物和非微生物危害的代表性食品安全应用。这些应用包括食源性微生物、毒素和残留物、重金属、转基因成分以及食品欺诈或掺假。同时，我们特别强调了近年来两个快速发展的方向：基于CRISPR的便携式和集成设备平台，以及人工智能在平台开发、数据解释和决策支持中的作用日益增强，从而更好地捕捉食品安全诊断中的主导发展趋势。最后，我们讨论了剩余的转化障碍，并提出了朝着稳健、标准化和可现场部署的食品安全监测系统发展的未来方向。

部分摘录

基于CRISPR/Cas的食品安全检测平台的模块化设计

基于CRISPR/Cas的检测方法为食品安全检测提供了模块化框架[32]。根据目标是否可以直接激活Cas效应器，食品相关目标被分为两类：直接激活Cas的目标和间接激活Cas的目标。直接激活Cas的目标是可以被Cas/crRNA系统直接识别的目标，从而触发Cas切割，例如病原体衍生的核酸或与基因相关的特征序列

CRISPR/Cas技术在食品安全风险因素检测中的应用

CRISPR-Cas技术已成为一种多功能平台，能够快速且特异性地检测多种风险因素[99, 127]。从应用角度来看，当前的基于CRISPR的检测方法大致可以分为两类：微生物危害和非微生物危害。微生物危害主要涉及食源性细菌、病毒和寄生虫，其中CRISPR通常用于检测病原体衍生的核酸，以实现敏感和特异性的识别。

结论与展望

本文总结了CRISPR/Cas在食品安全监测方面的最新进展，重点介绍了三个核心模块：目标识别（和转换）、信号增强和信号读出。通过组织这些模块中的代表性平台架构，我们强调了支持在复杂食品基质中进行快速、灵敏和现场适应性检测的集成设计原则。

CRediT作者贡献声明

周虎：撰写——审稿与编辑。陈晓萍：撰写——初稿。朱美玲：撰写——审稿与编辑。张英月：可视化、概念化。李毅：撰写——审稿与编辑。周一飞：撰写——审稿与编辑。李涛：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督。刘恒：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、概念化。李颖：撰写——审稿与编辑、监督、调查、资金获取

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

本文描述的研究未使用任何数据。

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致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（22574043, 22174150）、中国博士后科学基金会的博士后奖学金计划（C级）（GZC20251400）、湖北省自然科学基金（2023AFB527, 2023AFA052）、湖北省教育厅的研究基金（2024T011），以及重庆市科学技术局的科技创新与应用开发专项项目的财政支持。