《Frontiers in Veterinary Science》：Characterization of fecal bacterial microbiomes according to fecal color, consistency, and sample type in piglets before and after weaning
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粪便样本被广泛用作大肠微生物群的替代物；然而，表型特征（如颜色和性状）可能与不同的微生物谱相关，尤其是在断奶前后，此时饮食和生理适应会迅速改变肠道功能。在生理条件下，粪便表型、样本类型与仔猪肠道微生物群之间的关系仍不清楚。本研究调查了断奶前不久和断奶后立即仔猪
粪便样本被广泛用作大肠微生物群的替代物；然而，表型特征（如颜色和性状）可能与不同的微生物谱相关，尤其是在断奶前后，此时饮食和生理适应会迅速改变肠道功能。在生理条件下，粪便表型、样本类型与仔猪肠道微生物群之间的关系仍不清楚。本研究调查了断奶前不久和断奶后立即仔猪不同粪便表型中的细菌群落。研究人员在28日龄（DoL28）至36日龄（DoL36）期间每日对两个重复批次共192头仔猪的粪便性状进行评分，并在DoL28和DoL33收集粪便或直肠拭子样本。样本按类型（粪便/拭子）、颜色（棕色/黄色）和性状（球状/液态）进行分类。提取DNA以量化总细菌基因拷贝数并进行16S rRNA基因测序，使用QIIME2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2）、SAS（Statistical Analysis System）和R分析微生物组成。粪便性状随时间显著变化，从DoL28-32主要以球状为主转变为此后较软的粪便（p < 0.001）。日龄强烈影响微生物群结构，从DoL28到DoL33，Prevotella（普雷沃氏菌属）和Alloprevotella（另普雷沃氏菌属）的相对丰度显著增加，而Escherichia（埃希氏菌属）、Methanobrevibacter（甲烷短杆菌属）和Fusobacterium（梭杆菌属）的丰度下降。微生物群落在样本类型之间存在差异，拭子可能比粪便样本更密切地反映黏膜相关类群。Shannon和Simpson指数表明DoL28时黄色和液态粪便的多样性降低（p < 0.001）。DoL28时的拭子和黄色液态粪便显示出较高的Escherichia、Bacteroides（拟杆菌属）和Fusobacterium相对丰度，而棕色球状粪便在两个采样日均富含Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Prevotella和Lactobacillus（乳杆菌属）（p < 0.05）。总体而言，每种粪便表型都表现出独特的细菌特征，并且样本类型影响了所捕获群落的组成。监测粪便表型以及选择适当的样本类型可能会增强微生物组数据的解释，并为这一关键断奶期评估肠道健康提供一种实用的非侵入性方法。
研究背景：断奶是仔猪健康、福利和发育的关键时期。目前，粪便常被用作肠道（尤其是大肠）微生物群的代表性样本，因其易于收集且允许多次采样，大量研究聚焦于仔猪断奶过渡期的粪便微生物群动态以理解肠道 microbiota（微生物群）的变化。然而，断奶时母猪乳汁的突然移除导致肠道微生物类群底物可利用性的剧烈改变，使得降解牛奶聚糖（如乳杆菌科 Lactobacillaceae 和拟杆菌科 Bacteroidaceae）的类群大幅减少，而被更能降解植物淀粉和纤维的类群（如普雷沃氏菌科 Prevotellaceae、毛螺菌科 Lachnospiraceae 和 Kazachstania 酵母）取代。这些微生物变化可能导致宿主对自身微生物群的免疫耐受性降低，使仔猪更易受肠道紊乱影响。此前研究表明，分析粪便微生物组成有助于区分断奶后1周易发生断奶后腹泻的仔猪与健康仔猪，因此生命早期粪便微生物组成分析可能是早期诊断和及时干预以防止肠道菌群失调（dysbiosis）的有用工具。在实际操作中，可靠的粪便微生物群分析通常需要使用新排出的粪便，而在较年幼的猪中不一定总能收集到；若无法获得新鲜粪便，可使用替代的直肠拭子。棉质直肠拭子可抵抗环境污染物（如土壤和尿液），从而保留更可靠的微生物特征以供进一步分析。但关于直肠拭子样本是否能代表新鲜粪便，文献中存在争议：由于其靠近黏膜表面，直肠样本比粪便样本含有更多的糖蛋白降解类群（如梭菌科 Clostridiaceae、弯曲菌科 Campylobacteriaceae 和韦荣氏菌科 Veillonellaceae）；也有研究认为直肠拭子是粪便合适的替代物，差异较小且主要源于个体间和饮食变异而非样本类型变异。此外，腹泻仔猪的粪便表型具有特征性，通常为液态且有特殊气味；健康仔猪的粪便性状从硬颗粒到液态不等，颜色从黄色到灰色再到深棕色。由于断奶期的特殊性（社会与饮食应激及不成熟的肠道功能），断奶后立即出现较软、黄至浅棕色的粪便很常见。健康仔猪粪便的颜色变化和性状降低可能与饲料成分、胆汁分泌和/或肠道腔内未消化饲料残留物上微生物活性增加导致的渗透活性微生物代谢物有关，而不仅仅是病原相关共生菌（pathobiont）毒力因子表达增加。因此，基于表型评估粪便可能是确定异常肠道稳态条件的经济快速方法。但目前关于特定表型的粪便在断奶前后是否包含相似的指示细菌的信息仍然很少。研究人员此前小规模研究结果表明，纳入不同粪便表型会增加结果变异性，应予以考虑。为此，本研究旨在调查断奶前不久和断奶后立即较大规模仔猪队列（192头）中不同粪便表型的细菌群落，比较拭子样本与不同颜色和性状粪便的微生物组组成，以评估直肠拭子样本是否与某种粪便表型相似，并假设特定表型相关的细菌组成在断奶前后会有所不同，但特定表型的指示细菌在不同日龄间相似。
关键技术方法：研究人员在维也纳兽医大学教学农场的猪设施中，使用24头母猪的后代（两个重复批次，每批12窝，共192头临床健康仔猪）开展研究。从28日龄（DoL28，断奶日）到36日龄每日通过目视检查仔猪肛周区域和圈舍地面监测粪便性状并评分（1–5分制，含中间值）。在DoL28和33通过直肠刺激诱导排粪收集粪便样本，若无粪便则收集直肠拭子样本，样本按类型（粪便/拭子）、颜色（棕色/黄色）和性状（球状/液态）记录。DNA使用 DNeasy PowerSoil Pro Kit 提取，总细菌基因拷贝数通过 qPCR（定量聚合酶链反应）使用通用细菌引物定量；16S rRNA 基因 V3-V4 区扩增后由商业平台进行测序（目标深度每样本30,000条读数）。生物信息学分析使用 QIIME2 进行质量过滤、ASV（Amplicon Sequence Variant，扩增子序列变体）推断和分类学注释（基于 SILVA 138.2 数据库），α多样性（Shannon、Simpson 指数和 observed features）使用 R 包 phyloseq 分析，β多样性使用 Bray–Curtis 相异矩阵和 PERMANOVA（Permutational Multivariate Analysis of Variance，置换多元方差分析）评估。统计模型使用 SAS 9.4 的 MIXED 程序，考虑重复测量、固定效应（批次、性别、日龄及其交互等）和嵌套随机效应，显著性设为 p ≤ 0.05，趋势为 0.05 < p ≤ 0.10，必要时使用 Bonferroni 校正。
研究结果：
3.1 体重和粪便性状评分：断奶日（DoL28）仔猪平均体重7.6 ± 0.09 kg，DoL33增至7.8 ± 0.09 kg（p < 0.001）。粪便评分在DoL28至32间为3.5，DoL33和34降至3.0，DoL35和36回升至3.0和3.5（p < 0.001）。DoL28时仅2个样本为“液态粪便”，结果需谨慎解释。仔猪在DoL21–27预断奶期间平均每日消耗50 g DM（干物质）教槽料，DoL28–36断奶后每日消耗355 g DM 预 starter 日粮。
3.2 DoL28与DoL33间细菌群落差异：所有粪便表型间，DoL28与DoL33的总细菌基因拷贝数无差异（p > 0.05）。β多样性（PERMANOVA）支持DoL28和DoL33年龄相关的细菌群落差异。Shannon 指数α多样性从DoL28到DoL33增加（p < 0.05），Simpson 指数随时间无主要差异（p > 0.05）。日龄影响许多优势细菌属的相对丰度：DoL28时 Escherichia、Methanobrevibacter、Fusobacterium、Helicobacter（螺杆菌属）和 Clostridium sensu stricto 1（狭义梭菌属1）为优势类群，DoL33时丰度降低（p < 0.05）；反之，Prevotella、Lactobacillus、Alloprevotella、Prevotellaceae NK3B31、UCG-003 gut groups 和 Blautia（布劳特氏菌属）从DoL28到DoL33增加（p < 0.05）。
3.3 粪便样本类型间细菌群落差异：粪便每克样本基因拷贝数在DoL28和DoL33分别比拭子高0.8和0.6 log 单位（p < 0.001）；DoL × 样本类型交互显示DoL33拭子样本细菌丰度比DoL28高0.3 log 单位（p = 0.038）。PERMANOVA 表明DoL28和DoL33粪便与拭子样本的细菌群落均不同（p < 0.001），PCoA 显示样本类型在各自时间点有一定重叠。α多样性方面，Shannon 指数在DoL33两种样本类型均高于DoL28（p < 0.05），同日龄无差异；DoL28时 Simpson 指数粪便高于拭子（p < 0.05），DoL33时拭子 Simpson 指数增加至与粪便相似（p < 0.05）。分类学组成显示20个细菌属（占所有读数>75%）的相对丰度存在样本类型相关差异（p < 0.05）。DoL28时，粪便样本 Methanobrevibacter 和 Clostridium sensu stricto 1 高于拭子（p < 0.001），拭子 Escherichia、Helicobacter 和 Fusobacterium 高于粪便（p < 0.05）；DoL33时，粪便 Methanobrevibacter 仍高于拭子（p < 0.001），拭子 Prevotella、Prevotellaceae NK3B31、Erysipelotrichaceae UCG-003 gut group 和 Helicobacter 高于粪便（p < 0.05）。log2倍变化显示：Prevotella 和 Lactobacillus 在拭子中DoL28到DoL33分别增加1.5和1.0倍，粪便中分别增加0.6和0.7倍；Campylobacter（弯曲杆菌属）、Alloprevotella 和 Lachnospiraceae-1 在粪便中分别增加5.1、2.5和0.8倍，拭子中分别增加0.7、1.5和0.3倍；Escherichia 在拭子中减少5.0倍、粪便中减少1.5倍；Methanobrevibacter 和 Bacteroides 在粪便中分别减少2.0和2.5倍，拭子中分别减少1.5和1.9倍（p < 0.05）。
3.4 粪便颜色间细菌群落差异：DoL × 粪便颜色交互显示，DoL28棕色和黄色粪便基因拷贝数相似，均比拭子高0.9和0.7 log 单位（p < 0.05）；DoL33棕色粪便比黄色粪便和拭子高0.6和0.7 log 单位（p < 0.05）。PERMANOVA 支持不同颜色粪便的细菌群落差异（p < 0.001），PCoA 显示采样时间点聚类更明显，颜色与拭子聚类较少。α多样性方面，黄色和拭子样本DoL33多样性（Shannon 和 Simpson）高于DoL28，棕色粪便两日相似。20个细菌属（>75%读数）相对丰度因颜色不同（p < 0.05）。DoL28时，棕色粪便 Methanobrevibacter、Oscillospiraceae UCG-005、Clostridium sensu stricto 1、Blautia、Ruminococcus（瘤胃球菌属）和 Coprococcus（粪球菌属）高于黄色粪便和拭子（p < 0.05）；黄色粪便 Lactobacillus 和 Fusobacterium 高于棕色粪便（p < 0.05）。DoL33时，棕色粪便 Lactobacillus 高于黄色粪便（p < 0.05）；黄色样本 Lachnospiraceae-1 和 Alloprevotella 高于棕色粪便（p < 0.05）；Prevotella 在拭子和棕色粪便相似且高于黄色粪便；Campylobacter 在拭子和黄色粪便相似且高于棕色粪便（p < 0.05）。log2倍变化显示：Prevotella 和 Lactobacillus 在棕色粪便中DoL28到DoL33分别增加1.3和1.5倍，拭子中分别增加1.5和1.0倍，黄色粪便中分别减少0.9和1.4倍；Methanobrevibacter 在棕色粪便倾向减少2.3倍，黄色粪便和拭子中分别减少1.1和1.5倍；Escherichia、Fusobacterium 和 Bacteroides 在棕色粪便中分别减少1.8、1.5和2.8倍，黄色粪便中分别减少1.2、7.8和2.0倍，拭子中分别减少5.0、6.8和1.9倍（p < 0.05）。
3.5 粪便性状间细菌群落差异：总细菌基因拷贝数方面，DoL28球状和液态粪便相似，均比拭子高0.8 log 单位（p < 0.001）；DoL33球状粪便比液态和拭子高0.6和0.8 log 单位（p < 0.05）。PERMANOVA 支持样本性状的细菌群落差异，PCoA 显示性状类型与拭子在两日均有一定程度重叠。球状粪便细菌群落多样性高于拭子（p < 0.05），液态粪便与球状粪便和拭子DoL33多样性相似。18个细菌属（>70%读数）相对丰度因性状不同（p < 0.05）。DoL28时，球状粪便 Oscillospiraceae UCG-005 高于拭子（p < 0.05）；2个DoL28液态粪便样本 Escherichia 显著高于较硬粪便和拭子（p < 0.05）；液态粪便和拭子 Bacteroides 高于球状粪便，球状粪便 Methanobrevibacter 高于拭子（p < 0.05）。DoL33时，球状粪便 Lactobacillus 高于液态样本和拭子（p < 0.05）；球状和拭子 Prevotella 高于液态粪便（p < 0.05）；Escherichia 相对丰度在球状、液态和拭子间相似（p < 0.05）。log2倍变化显示：Escherichia 在所有表型间DoL28到DoL33普遍减少4.5–5 log2单位；液态粪便中 Treponema（密螺旋体属）、Campylobacter 和 Helicobacter 分别增加3.9、11.2和5.0倍，球状粪便和拭子这些变化较不剧烈；Fusobacterium 在球状粪便中减少10.0倍，黄色粪便中减少6.2倍（p < 0.05）。
讨论与结论总结：更好地理解仔猪肠道微生物群定植模式有助于设计监测和干预策略以支持断奶期肠道健康。断奶期间应激和不成熟肠道功能常改变粪便外观，即使无病原体存在。用于粪便微生物群研究的样本类型包括粪便、活检组织、腔壁黏膜样本和肠道灌洗液等，目前仍存在哪种样本可代表粪便样本（如黏膜拭子）的争论，尤其在难以获得粪便时。此外，针对黏膜表面的采样策略（如细胞刷）可能比黏膜拭子更能代表上皮相关微生物群，但结果可能因采样深度而异；然而细胞刷更具侵入性，在纵向或大规模研究中不太实用。因此本研究比较了粪便和直肠拭子（猪仔中广泛使用且经验证的采样方法，代表最小侵入性且适用于农场水平的微生物群评估）。研究人员此前小规模研究表明，相似性状但不同颜色的粪便中细菌微生物群存在差异；因此本研究在较大队列中筛查了断奶前和断奶后5天（仔猪易发生断奶后腹泻的时期）的细菌微生物群。结果证实细菌群落随收集样本类型和粪便表型特征（以及断奶前后）而变化。数据显示，DoL33液态粪便中并不显著增加含致病因子的属，而是 Lactobacillus 丰度较低为特征差异，应与病原体过度生长区分。数据进一步表明，根据表型区分粪便也可提供关于断奶前后植物性食物摄入和肠道功能的信息。本研究将粪便样本分为较宽泛的表型类别，未考虑中间外观，未来可使用数字工具更好捕捉自然变异性；此外，靶向16S rRNA基因 V3–V4 区主要允许属水平分类学分辨率，限制种或菌株间功能或致病作用的区分。此外，有必要将拭子样本与细胞刷等替代采样工具比较以更好地定位所选方法；细胞刷可能有利于靶向黏膜研究，但其在仔猪直肠采样中相对于拭子的附加价值尚未明确。每日监测的粪便性状变化与文献中断奶后第一周报道一致；DoL32前粪便普遍较硬可能是由于断奶后最初几天采食量低导致通过率降低。虽然仔猪在断奶前被提供预 starter 日粮作为教槽料，但断奶应激（如移动、与母猪分离、重新组群、完全依赖固体饲料营养）可能导致采食量下降。DoL33–36较软粪便增加可能反映采食量恢复和饲料变化（尤其缺乏母猪乳汁），更成熟消化功能和较高采食量使更多底物在DoL33后到达大肠并被发酵，产生的微生物代谢物可能具有渗透效应；此外，DoL28到DoL33细菌群落改变可能引起肠道黏膜免疫反应，导致肠道分泌作用增加，从而使仔猪排出较软粪便。断奶在DoL28进行，因此当日分析的粪便细菌群落仍代表以乳汁为基础的饮食；相应地在DoL28，具有糖苷水解酶活性的 Bacteroides、Clostridium sensu stricto 1、Ruminococcus 和 Fusobacterium 等属相对丰度较高，DoL33因底物缺乏而下降。DoL33时，群落已适应植物性预 starter 日粮，以专门发酵复杂植物碳水化合物的细菌为主，如 Alloprevotella、Lactobacillus、Oscillospiraceae 和 Lachnospiraceae 丰度增加。基因拷贝数在DoL28和DoL33几乎相似，表明细菌群落变化主要通过分类学组成改变而非总细菌负荷改变发生。然而，仅 cereal基预 starter 日粮促进了断奶后5天粪便细菌群落多样化（α多样性指数 Shannon 和 Simpson 更高），与先前新断奶猪的发现一致。在所有样本类型和表型中，PCoA 图显示日龄是细菌群落分离的主要驱动因素，而 PERMANOVA 表明采样日和样本类型或表型具有显著影响；可能的解释是 PERMANOVA 可检测高维空间中的细微差异，而 PCoA 主要强调变异的主要来源。研究人员首先分析样本类型数据（不考虑颜色和性状），数据与先前观察一致，支持粪便与拭子样本差异，突出采样方法对粪便微生物群组成结果的影响。因此，拭子样本可能更密切反映黏膜群落，而不能准确反映粪便中细菌群落。此前 Choudhury 等在DoL3–20哺乳仔猪中得出结论拭子与粪便细菌群落可比，差异可能源于拭子采样的直肠黏膜中消化残留物量不同。本研究中拭子和粪便样本多样性相等，可能表明两个肠道生态位具有相似的有利生长条件和微生物相互作用。基因拷贝数表明直肠黏膜细菌生物量少于粪便，可能与大肠内容物营养物质可用性及细菌粘附和利用黏液作为底物的特性有关。粪便和拭子间基因拷贝数差异断奶前大于断奶后，可能表明由于消化物中残留纤维较多，直肠黏膜黏液层可能更厚，作为细菌底物促进细菌生长。粪便和拭子的分类学组成反映两个肠道生态位，与先前研究相似；因此，具有黏蛋白降解能力的 Escherichia、Bacteroides、Campylobacter、Helicobacter 和 Fusobacterium 等种属可能解释拭子中这些属丰度高于粪便。尽管其中一些类群包含病原相关共生菌，但它们属于猪肠道黏膜中的共生细菌群落。研究人员预期植物多糖残留会促进断奶后粪便中 Prevotella 相对丰度增加，与先前研究类似；然而 Prevotella 在DoL33粪便中比拭子少，表明直肠黏膜黏蛋白组成促进了 Prevotella 内黏蛋白降解种；此外，具有相似底物偏好的其他类群可能取代了 Prevotella，因此高丰度的 Lactobacillus 及毛螺菌科和普雷沃氏菌科内较低丰度属似乎是粪便中主要的碳水化合物发酵类群。DoL28到DoL33其他属相对丰度变化可由饮食引起的代谢物可用性变化导致的互养关系差异解释。接着，研究人员比较了基于表型的仔猪粪便细菌群落，并额外与拭子样本比较以确定特定表型相关细菌群落是否更接近拭子样本中的群落。在哺乳阶段，仔猪粪便黄色是其乳汁摄入的指标；当仔猪开始摄食植物性预 starter 日粮，粪便颜色变为棕色，这可与胆汁分泌变化及胆汁和植物饲料残留物上的微生物作用相关。然而断奶前所有窝中预 starter 日粮摄入低，一些仔猪可能未消耗教槽料，因此粪便颜色变化可能是监测仔猪固体饲料摄入的有用指标。相应地在DoL28，棕色粪便区别于黄色粪便表现为较高丰度的 Ruminococcus、Coprococcus 和 Christensenellaceae R-7 group（涉及植物源碳水化合物降解），可能表明DoL28时植物聚糖消耗；若猪大肠中互养关系类似牛瘤胃描述的关系，Ruminococcus 和 Christensenellaceae R-7 group 碳水化合物发酵产生的氢可能被氢营养产甲烷菌如 Methanobrevibacter 利用，解释DoL28该属高丰度。有趣的是，DoL28黄色粪便中 Lactobacillus 为优势属，可能与牛奶聚糖发酵相关。断奶后，棕色粪便中 Lactobacillus 丰度与断奶前黄色粪便相似且高；由于饮食聚糖组成从断奶前到断奶后改变，可假设DoL28和DoL33存在不同种。仔猪断奶后饲喂相同日粮，应对粪便颜色有相同影响；可能由于去除脂肪母猪乳汁和预 starter 日粮极低摄入，黄色粪便仔猪在断奶后几天胆汁产生比较棕色粪便仔猪下降更显著，胆红素（胆汁组分）微生物降解赋予粪便特征颜色，极低采食量可能使黄色粪便仔猪 Lactobacillus 饥饿，采食量恢复后 Lachnospiraceae-1 和 Alloprevotella 可能部分取代黄色粪便DoL33中 Lactobacillus 的生态位。仅 Campylobacter 这一病原相关共生菌在DoL33黄色粪便中较高丰度可能表明肠道稳态 disturbance，也可能与粪便中黏液较多有关。关于性状，粪便分为液态和球状两组（栏内易区分）。需注意DoL28极少仔猪有液态粪便，似乎与 Escherichia
