《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Deciphering skeletal muscle development: cellular heterogeneity and molecular regulatory networks from single-cell and spatial transcriptomic perspectives
骨骼肌发育是一个高度复杂且精密调控的生物学过程，涉及多种细胞与分子事件在时空维度上的协同作用。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学（ST）技术的进步，使研究人员得以在单细胞分辨率下系统解析骨骼肌动态变化，从而揭示其潜在的分子调控机制。本综述系统梳理了现有证据，阐述了骨骼肌发育过程中细胞异质性的分子组成，以及转录因子网络、表观遗传调控与代谢重编程在细胞命运调控中的协同作用。通过跨物种（包括人、小鼠、猪和鸡）研究结果的系统比较，研究人员既强调了进化上保守的机制，也揭示了物种特异性的调控特征。scRNA-seq、ST与多模态数据的结合，使研究人员得以理解微环境作为肌肉干细胞（MuSC）行为空间调控因子的作用：包括生态位组成、细胞间通讯和机械信号等方面。这些发现不仅阐明了骨骼肌发育的基本原理，也为肌肉相关疾病的治疗策略以及畜禽经济性状的改良提供了理论基础。
1 引言
中胚层体节通过一系列复杂的分化过程形成骨骼肌，最终发育为成熟的肌纤维，这一过程涉及成肌祖细胞（MPCs）的增殖、分化、迁移与融合，以及MPCs、肌肉卫星细胞（MuSCs）、成纤维细胞和免疫细胞等多种细胞类型的时空精准协调。从胚胎期MPC的发生分化，到出生后生长、成熟、肌纤维类型分化，再到成年肌肉稳态维持与修复，多层级分子调控网络控制着骨骼肌发育的每个阶段。scRNA-seq和ST技术的引入，使研究人员能够以远超以往的分辨率表征细胞异质性和组织的空间结构。
2 基于scRNA-seq阐明肌肉发育动态
scRNA-seq技术的发展使研究人员得以在单细胞尺度上系统描绘肌肉发育的细胞谱系轨迹，识别新的细胞亚型，并绘制分化路径，极大地拓展了对复杂组织架构的理解。
2.1 MuSC亚群的鉴定
MuSC是维持成年骨骼肌稳态和损伤后再生的核心细胞。scRNA-seq和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）的应用克服了传统表面标志物分选方法的局限，实现了对MuSC异质性的无偏解析。
基于约22,000个人类成年肌肉细胞的大规模单细胞测序研究，研究将MuSCs明确分类为静息态和早期激活态两个亚群。静息态MuSCs高表达Pax7、DLK1和CHRDL2，而早期激活态MuSCs则表现出持续的Myf5表达和Pax7的逐渐下调。这两个亚群在增殖潜能、分化倾向和自我更新能力方面存在显著差异。Pax7作为MuSCs的核心调控因子，其表达水平直接决定细胞命运：高Pax7亚群具有较强的非对称分裂能力和更稳定的静息态维持能力，负责干细胞库的自我更新；低Pax7亚群则更容易退出静息态并启动分化，主导损伤后的肌纤维重建。这种梯度表达模式是MuSC命运决策的核心分子开关，在包括小鼠、人类和猪在内的哺乳动物中高度保守。然而，物种间存在特异性差异：例如，猪MuSCs表现出更广的Pax7表达范围和更渐进的向Myf5+状态转变，反映了对不同出生后生长速率的适应。
snRNA-seq进一步在功能层面上将MuSCs分为增殖性亚群和储备亚群。增殖性MuSCs高表达MKI67和CCND1等细胞周期基因，负责损伤后的快速扩增；储备性MuSCs则表现高Pax7和低Myog表达，保留干细胞特性，是再生后干细胞库重建的核心细胞群体。
MuSC异质性还表现出明显的解剖位置特异性。源于眼外肌（EOM）的MuSCs高表达Pitx2，而源于胫骨前肌（TA）的MuSCs则优先表达Pax3。这种区域特异性的转录特征构成了不同肌肉功能适应的分子基础，也导致了来自不同解剖部位MuSCs在再生能力和移植效率上的固有个体差异。近期研究进一步鉴定了一种新型的CAV1+ MuSC亚群，其特征为优越的移植能力和低增殖活性，是成年肌肉干细胞稳态维持和细胞治疗的理想种子细胞。
2.2 新型细胞亚群的表征
scRNA-seq的高灵敏度使其能够识别仅占细胞组成很小部分的新细胞群体。在人类骨骼肌研究中，研究人员发现了两种新的细胞类型：内皮-周细胞和间质肌腱细胞。内皮-周细胞表达内皮细胞和血管周细胞的标志物，可能在血管稳定性调节和肌肉微环境中发挥专门作用；间质肌腱细胞则特异性表达肌腱相关基因如SCX和TNMD，提示其可能参与肌腱连接处的稳态维持和修复过程。此外，在肌肉-肌腱界面还鉴定到一群共表达成肌祖细胞和肌腱细胞标志物的独特细胞群，表明这两种细胞类型之间可能存在过渡态细胞。
2.3 谱系轨迹重建
成年MuSC分化遵循连续轨迹：静息激活→增殖扩增→定向分化→融合成熟。利用小鼠损伤-再生模型和成年人类肌肉细胞，scRNA-seq结合拟时序分析和RNA速度分析重建了这一过程的连续细胞状态转换和核心调控轴。
2.3.1 成年MuSC分化过程中的连续状态转换
静息态MuSCs（Pax7
+, Sdc4
+）感知损伤信号后，迅速上调Myod1和Islr进入激活态，随后进入增殖期（Mki67
+, Top2a
+）并大量扩增以满足肌肉修复需求，最终上调Myogenin和Myh3，退出细胞周期并融合形成新的肌纤维，完成分化。
2.3.2 核心信号通路与调控节点
决定成年MuSC命运的核心信号通路高度保守：NOTCH信号主导静息态维持和自我更新，通过NICD-RBPJ轴抑制分化；MEK/ERK信号调控增殖扩增并驱动细胞周期进程；RXR信号参与分化启动并与Myogenin协同促进终末分化。这些通路的精确时序激活对于平衡干细胞库维持和肌纤维再生至关重要。
2.3.3 物种保守性与人类特异性特征
成年MuSC分化的核心调控轴在小鼠和人类之间高度保守，均遵循Pax7→Myf5/Myod→Myogenin的转录级联。然而，人类MuSCs表现出更缓慢的激活和分化动力学，伴随更高的静息维持相关基因表达水平。人 pluripotent stem cells（PSCs）来源的肌源性祖细胞与自然发育肌细胞的比较转录组分析揭示，hPSC-PAX7细胞 closely resembles 胚胎-胎儿过渡期细胞，为体外肌肉发育建模和细胞治疗的标准化种子细胞提供了可靠系统。
RNA速度分析证实，成年肌肉中的周细胞具有多谱系分化潜能，可分化为肌源性祖细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种细胞类型，作为重要的储备细胞群体参与损伤后的微环境重塑和细胞补充。
2.4 转录调控网络的解析
控制骨骼肌发育的转录调控网络具有精密的时空特异性，其基本机制涉及成肌调节因子（MRFs）与其调控因子之间的协同互作。Pax3和Pax7作为早期主要调控因子，均标记原始成肌细胞群体。在胚胎发生过程中，Pax3直接调控Fgfr4的成肌增强子，并通过早期epaxial增强子（EEE）间接调控Myf5表达。Six家族同源域转录因子如Six1和Six4通过靶向Myf5和Myod基因的增强子直接调控下游成肌因子的表达。
成肌决定因子Myod和myogenin在肌细胞分化过程中受到细胞周期的差异性调控：Myod在G1期的上调促进分化承诺，而Myf5在G0期的上调则抑制分化承诺。在C2C12分化模型中，Myod mRNA水平在分化过程中变化不大，而myogenin mRNA水平在早期分化阶段显著上升后趋于平稳，表明myogenin可能是肌浆网（SR）基因和收缩蛋白基因表达的重要转录调控因子。
多条重要信号通路参与协调细胞生长与命运决定。InR/Akt/TORC1信号通过其效应复合物TORC1直接稳定SOCS36E蛋白，该蛋白也是JAK/STAT信号的抑制因子。值得注意的是，尽管JAK/STAT通路是定义滤泡细胞迁移命运的重要信号通路，InR/Akt/TORC1与JAK/STAT通路在肌肉发育过程中呈拮抗关系。
Notch信号通路对于维持肌肉干细胞静息态至关重要。当Notch胞内结构域（NICD）与DLL1/4配体结合时，释放转录因子RBPJ。同时，FOXO3信号通路也有助于肌肉干细胞静息态的维持，但其表达随年龄增长而缓慢下降。这些结果凸显了转录调控网络的协同性质，多种信号系统的组合通过高度复杂的串扰定义细胞命运。
2.5 表观遗传修饰景观
表观遗传信息的整合拓展了多组学研究的维度。单细胞多组学方法通过鉴定染色质可及区域，解释了转录因子与DNA上调控元件之间的动态交叉。scRNA-seq与scATAC-seq的结合可用于系统性描述成肌过程中转录因子介导的调控事件。
肌肉干细胞命运决定的主要机制是染色质可及性与转录调控的协同组合。研究表明，在hEMuSCs向神经祖细胞（NPCs）分化过程中，2,438个基因同时发生表达和染色质可及性变化，其中上调和下调基因分别为1,489和949个。具体而言，肌肉干细胞中的Pax7通过招募Trithorax复合物增加H3K4me3修饰水平来实现与染色质开放性的关联，而Myod则是唯一通过与多种表观遗传调控因子相互作用来控制靶基因表达的蛋白。
染色质可及性的动态重塑伴随肌肉干细胞状态的转变。EZH1-PRC2复合物通过非经典Notch信号在静息态维持细胞静息；前列腺素E2（PGE2）通过表观遗传抑制AP1结合位点和表观遗传放大再生相关调控元件CREB和E-box来重组肌肉干细胞的转录网络。移植实验还证实，EOM MuSCs能够部分重编程其表观遗传组状态以适应新的环境需求。
值得注意的是，肌肉发育的表观遗传调控具有高度时空特异性。p38-α/β MAPK通路通过抑制RNA去稳定蛋白tristetraprolin（TTP）来触发MYOD蛋白的表达，这是一种转录后而非转录水平的机制。猪骨骼肌发育研究表明，肌母细胞分化途径的基因表达和染色质可及性动态变异性与明确的转录因子活性相关。肌源性相关基因在瘦肉型猪肌肉细胞中表现出增强的染色质可及性，而脂肪生成相关基因则在肥胖型猪中具有更高的可及性，这为瘦肉率与肌内脂肪（IMF）浓度呈负相关提供了直接的分子解释，也为猪育种基因组选择中的表观遗传生物标志物研究提供了依据。
3 空间结构模式
ST技术的出现为肌肉组织三维分子组织研究提供了新机遇，该技术结合空间坐标与基因表达模式，可精确定位肌肉组织中的特定细胞类型，并阐明这些空间分布模式与局部微环境动态相互作用的关系。
3.1 ST技术方法
ST代表快速发展的研究工具，其核心本质是将基因表达数据与空间数据相结合，以在原始组织环境中对RNA分子进行原位分析。对于骨骼肌研究，评估空间转录组技术的核心指标包括：其分辨率/斑点直径能否覆盖MuSC生态位（约10-30 μm）、能否区分单核MuSCs与多核肌纤维、以及能否捕获肌纤维修复区域的局部微环境信号。
在基于测序的ST技术中，Visium因其能够同时以亚细胞分辨率分析数百至数千种RNA物种的空间分布而脱颖而出。MERFISH属于最成功的基于成像的ST技术类别，能够同时在亚细胞水平上研究数百至数千种RNA物种的空间分布，特别适用于检查患者细胞中相对低丰度的病理特征。Stereo-seq技术是华大基因自主研发的近期ST进展，利用DNA纳米球创建分辨率达500 nm的测序芯片技术，覆盖面积达13 cm × 13 cm的捕获区域。
3.2 时空发育动态
组织区域化对MuSC生态位和肌核异质性具有重要意义。骨骼肌形成涉及特定解剖部位各种成肌祖细胞的分化，这在躯干肌肉形成中表现尤为明显。Epaxial和hypaxial肌肉具有不同的祖细胞，且组织微环境对其调控方式不同。
在骨骼肌发育过程中，两个核心阶段依次发生：初级肌生成（胚胎期）和次级肌生成（胎儿期）。初级肌生成主要形成早期肌管并建立肌肉的基本空间架构，而次级肌生成则导致肌纤维数量的大量增加，直接决定动物的产后肌肉质量和总肌纤维数。不同物种的初级和次级肌生成时间窗口存在显著差异：小鼠中，初级肌生成主要发生在胚胎第10.5-12.5天，次级肌生成集中在第14.5-16.5天；猪中，初级肌生成发生在妊娠第30-35天，次级肌生成跨越第35-91天；人类中，初级肌生成对应胚胎发育第4-6周，次级肌生成发生在第8-14周。
肌纤维类型的空间分布模式与其生理功能密切相关。Type I纤维线粒体丰富、氧化酶活性高，具有缓慢而持久的收缩特性；Type IIb纤维糖原丰富、ATP酶活性高，主要促进快速但短暂的收缩。ST数据显示，MYH1（Type IIx）和MYH7（Type I）基因的表达模式呈明显的互斥分布，且这种表达特征在不同解剖部位的肌肉之间存在显著的位置特异性变异。
近期snRNA-seq研究揭示，单个多核肌纤维内的肌核在转录上并非完全相同。已鉴定出多种肌核亚型，包括专门用于神经肌肉连接和肌腱连接处维持的亚型，以及富集分泌因子的亚型。ST技术正开始绘制这些肌核亚型的精确定位及其与静息态和激活态MuSCs的空间关系。
MERFISH技术的应用极大促进了病理条件下基因表达空间异质性的理解。面肩肱型肌营养不良症（FSHD）患者肌肉组织中DUX4靶基因表现出异常高的表达模式，这些空间异质性表达模式提示其在疾病发病机制中可能发挥关键作用。
3.3 跨发育和再生过程的MuSC行为微环境调控
在骨骼肌发育过程中，微环境信号通过复杂的调控机制协调细胞命运决定和异质性维持。Notch信号通路通过接触依赖性相互作用促进SC自我更新，而FGF信号通路则通过MAPK级联调控MPCs的增殖和分化。然而，发育和再生过程中MuSC微环境的组成和调控逻辑存在显著差异。
ST研究揭示了肌肉再生过程中的有趣现象：FAPs高表达Mdk，而其受体基因（Ncl、Sdc4、Lrp1）在各种成肌细胞类型中显著富集，这表明FAPs支持成肌分化的保守互惠信号轴。近期scRNA-seq进一步解析了特定的FAP亚群，如Wisp1
+亚群在损伤后早期短暂激活，是促成肌和ECM重塑信号的关键来源。
ECM作为微环境的重要组成部分，在肌纤维形成中具有紧密排列的结构。ECM不仅是机械支架，还调控细胞行为，其中整合素介导的信号参与这一过程。ECM的组成和硬度是MuSC命运的有力调控因子：僵硬的ECM（纤维化组织的特征）促进YAP/TAZ信号，以牺牲自我更新为代价驱动MuSC增殖，导致再生失败；而模拟健康肌肉的柔顺ECM则支持静息态和高效修复。
4 多模态数据整合分析解析肌肉发育
scRNA-seq和ST数据的有效整合需要多步骤分析框架，以解决其互补优势和局限性。整合通常通过三种核心策略进行：参考映射（将scRNA-seq的细胞类型注释投射到ST切片上以解卷积空间位点）、联合嵌入（采用Harmony、LIGER或Seurat V5等算法在共享低维空间中对齐scRNA-seq和ST数据集）以及空间网络建模（结合空间坐标与单细胞表达谱重建配体-受体对和细胞间通讯）。
scRNA-seq和ST技术的结合为探索肌肉发育的分子机制提供了新视角。这种整合不仅是叠加性的，而且是协同性的，因为它使研究人员能够将单个细胞的转录组状态映射到其在组织中的精确空间坐标上，从而推断调节细胞命运的细胞间通讯网络和空间生态位。通过单细胞和空间转录组数据整合，Zhang等创建了人类胚胎骨骼肌生成发育的时空单细胞转录组图，定义了具有不同细胞状态和基因表达程序的两个阶段。
计算模型的最新创新为ST和scRNA-seq数据的分析做出了重要贡献，特别是在降维、轨迹推断和网络重建方面。GCNG方法利用图卷积网络将空间数据转换为图形式，并与基因表达数据联合学习，有效发现了多种新的配体-受体相互作用。Banksy算法通过整合细胞基因表达谱与其空间邻域特征，显著增强了组织架构分辨率。DEAPLOG算法能够沿细胞分化路径精确定位动态基因表达变化。iSCALE方法通过整合Visium平台的多个亚捕获区域，实现了组织范围的基因表达景观重建。
5 发育异常与疾病机制
骨骼肌发育异常与多种病理状况密切相关，表现出复杂的分子机制和细胞异质性。肌营养不良症是一组以进行性肌肉变性和再生受损为特征的遗传性疾病，涉及多种分子通路和细胞异常。杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的形式，由DMD基因突变导致dystrophin蛋白完全缺失，进而引起肌膜不稳定和慢性肌肉损伤。mdx小鼠作为经典的DMD模型，携带dystrophin基因外显子23的点突变，产生提前终止密码子，破坏dystrophin-糖蛋白复合体（DGC）功能。
近期单细胞时空图谱分析揭示，PITX1在上下肢骨骼肌模式形成中发挥核心调控作用，其失调直接导致短指或多指等形态改变。冷冻电镜结构分析进一步证实，Lamin A/C的构象变化是年龄相关性肌肉功能衰退的关键分子事件。
6 临床与农业转化研究
scRNA-seq和ST技术的协同发展充分破译了涵盖"细胞类型-空间位置-功能状态"的三维基因表达信息。这一技术范式正推动转化医学和精准农业的进步。
6.1 临床应用与转化研究
哈佛大学的SkMo培养系统实现了肌母细胞去分化效率73%±9%的技术突破，移植的人工MuSCs产生138±20.49 kN·m
-2的特定力量。该系统与CRISPR基因编辑技术结合时，可将遗传性肌营养不良症的基因修正率提高约12%-89%。
在衰老背景下，scRNA-seq已精确定位衰退的细胞机制：肌肉干细胞数量在老年期较成年人减少62%，FOS
+预激活干细胞比例增加，导致增殖能力下降34%。通过AAV递送Wnt7a因子可显著提高肌肉再生率。
衰老过程中肌肉再生的衰老标志物动态已被scRNA-seq研究阐明。研究人员在老龄小鼠肌肉损伤部位发现了具有衰老特性的独特成肌干细胞亚群，其特征为Cdkn2a和Cdkn1a的共表达。此外，人类肌肉干细胞研究揭示，累积的炎症条件导致激活的干细胞异常表达炎症标志物。
6.2 动物育种与人造肉中的农业应用
scRNA-seq和ST技术阐明的细胞和空间原理为革新动物育种提供了巨大前景，使理解从组织水平向细胞水平转变。关键细胞亚群的鉴定为精准育种提供了细胞学基础：CAV1
+ MuSCs的发现可能启发体外肌肉干细胞扩增和选择策略，以增强瘦肉组织生长；猪早期产后PAX7
+ MuSCs的活性是最终肌纤维数量的关键决定因素；ST可解析的MYH1（快速糖酵解）与MYH7（慢速氧化）纤维比例直接影响牛肉和猪肉的质地和持水能力。
人造肉领域同样受益于scRNA-seq和ST的洞见。scRNA-seq已用于定义分化的最佳细胞状态，识别高增殖性"储备细胞"的标志物，并揭示必须调控的信号通路（如MEK/ERK、NOTCH）以驱动有效的成肌承诺和融合。ST可进一步指导3D支架和生物反应器微环境的工程化，通过绘制天然组织中纤维、ECM和生态位细胞的空间组织，模仿这些技术鉴定的空间模式化信号，创造具有更高架构和质地保真度的人造肉产品。
7 挑战与未来展望
尽管scRNA-seq和ST技术为肌肉发育研究提供了新途径，但其应用受到多种技术限制。scRNA-seq的主要局限在于mRNA捕获率低，现有技术仅能实现10-20%的mRNA分子逆转录。ST虽能保留宝贵的空间数据，但分辨率-吞吐量权衡问题持续存在。一个特别关键且肌肉特异性的挑战是，标准scRNA-seq流程依赖于将新鲜组织解离为单细胞悬液，无法捕获构成肌肉组织主体的多核肌纤维。这些肌纤维太大且脆弱，无法存活于解离过程，意味着scRNA-seq本质上仅采样单核间质和干细胞群体。
数据分析的困难同样需要认真考虑。ST数据的稀疏性需要 neighorhood 的明确界定，且细胞高度异质性。现有单细胞和空间数据的整合技术尚不成熟，特别是当数据来自不同技术平台时。尽管存在多种批次效应校正算法，但在处理scRNA-seq高维且高度稀疏的数据时，区分生物学信号和技术信号仍然困难。
未来研究方向包括：优化能够建模ST数据中长程细胞依赖性的Transformer架构；创建能够协调scRNA-seq、表观基因组和蛋白质组等多维数据集的新算法；发展能够在同一完整肌纤维内同时测量基因表达和空间定位的技术；建立标准化的分析流程和数据共享平台；以及提高ST技术的分辨率。
8 结论
scRNA-seq和ST的最新发展显著提高了对肌肉发育分子层面调控的理解。这些技术已在胚胎至成年发育时期产生了高分辨率的细胞图谱，揭示了细胞异质性和动态转换；阐明了重要转录因子、信号通路和表观遗传修饰参与命运和组织模式形成的复杂调控网络；并为各种肌肉疾病的病理机制提供了深入理解。尽管存在样本制备、分辨率限制、数据整合和成本效益等方面的困难，但快速的技术进步，特别是更高分辨率的空间平台、多模态整合和人工智能驱动的分析，将继续推动该领域的发展。将这些技术应用于主要畜禽物种，将在解析生产性状的细胞和空间基础方面发挥重要作用。将单细胞和空间多组学数据与基因组预测模型相结合，有望提高育种值估计的准确性，最终为更精准、环境友好型的动物育种和肉类生产提供突破。
