基于CRISPR-Cas13a的两步法联合侧向层析试纸条用于Epstein–Barr病毒快速检测

《Frontiers in Microbiology》：A CRISPR-Cas13a–based two-step assay combined with lateral flow strips for rapid detection of Epstein–Barr virus

　　

摘要 背景：Epstein–Barr病毒(EBV)是一种广泛分布的人致癌病毒，与多种人类恶性肿瘤密切相关。准确检测EBV DNA对疾病筛查与监测至关重要，但目前常用方法如定量聚合酶链反应(qPCR)依赖专用仪器与实验室基础设施，限制了其在资源有限环境中的应用。 方法：研究人员开发了一种用于EBV DNA检测的等温核酸检测方法，将重组酶辅助扩增(RAA)与CRISPR/Cas13a检测相结合。目标DNA在恒温条件下扩增，随后由Cas13a介导的附带RNase活性触发标记报告分子的切割，产生可检测信号。荧光测量与侧向层析试纸条分析被用于结果判读。 结果：荧光检测的动态范围可达每反应107拷贝，检测限(LoD)为每反应101拷贝，无交叉反应。侧向层析试纸条在每反应104拷贝及以上浓度可见阳性结果。在临床血液样本的初步可行性评估中，荧光法和侧向层析法的阳性检出率分别为100%和84.6%（11/13），且两种方法均对受试对照病毒无交叉反应。 结论：本研究建立了一种两步法RAA–CRISPR/Cas13a检测EBV DNA的平台，兼具分析灵敏度与无需仪器的可视化读出优势。结果表明该平台在EBV筛查中的技术可行性，但需进一步优化以提升视觉读出的灵敏度。大规模临床研究对于全面确定其诊断性能及在分散化和资源有限环境中的实际应用价值至关重要。

论文解读

研究背景与意义

Epstein–Barr病毒(EBV)是一种全球广泛分布的人类γ疱疹病毒，超过95%的成人携带并终身潜伏感染(Gao et al., 2025)。虽然原发感染通常轻微或无症状，但持续感染与鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多种恶性肿瘤密切相关(Zhang et al., 2009; MüNZ, 2025)，也与多发性硬化等非恶性疾病有关(Bar-Or et al., 2020; Damania et al., 2022)。因此，准确检测EBV DNA对临床诊断和疾病监测尤为重要，尤其在鼻咽癌高发地区(Tan et al., 2020)。当前主流方法是定量聚合酶链反应(qPCR)，虽灵敏可靠，但依赖昂贵设备、稳定电力和专业操作人员，难以在初级医疗机构和资源有限环境中推广(Chinna et al., 2023)。为此，研究人员旨在开发一种简便、快速、便携的EBV DNA检测方法，以适配分散化检测需求。

关键技术方法

本研究采用重组酶辅助扩增(RAA)与CRISPR/Cas13a联用的两步策略。首先针对EBV核抗原1基因(EBNA1)保守区设计引物与crRNA，RAA在恒温条件下快速扩增目标DNA；扩增产物经T7 RNA聚合酶转录为单链RNA后，由Cas13a识别并激活附带RNase活性，切割荧光或侧向层析报告探针。检测体系分别采用荧光信号读取和侧向层析试纸条可视化判读。临床样本来自北京佑安医院确诊EBV感染患者的血液，同时设置巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)等对照病毒进行特异性验证。

研究结果

优化RAA–CRISPR检测体系

通过筛选四组RAA引物组合，确定F1R2扩增效率最高；进一步评估四种crRNA，选定信号最强且最稳定的crRNA4作为引导RNA；温度梯度实验表明39℃为最佳反应温度，可获得最快信号积累与最高荧光输出。

分析灵敏度

以系列稀释EBV质粒为标准，荧光检测动态范围为10⁷至10¹拷贝/反应，检测限(LoD)为10¹拷贝/反应；侧向层析试纸条的可视LoD为10⁴拷贝/反应，低于此浓度时无可见测试线。

分析特异性

序列比对显示EBNA1靶区的RAA引物结合区和crRNA结合区在其他常见疱疹病毒（HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、HHV-8）中无同源序列；荧光检测中，所有非靶标病毒信号与无模板对照无显著差异，证实无交叉反应。

临床样本初步可行性评估

13例qPCR确认的EBV阳性全血样本中，荧光法全部检出（100%），侧向层析法检出11例（84.6%）；三例非靶标病毒样本及阴性对照均为阴性，无假阳性。

讨论与结论

本研究建立的RAA–CRISPR/Cas13a平台结合了等温扩增与CRISPR序列识别的优势，在保证灵敏度的同时减少对复杂设备的依赖，适合分散化检测。荧光法灵敏度高，适用于实验室精确检测；侧向层析法无需仪器，便于资源有限地区的快速筛查。当前两步法存在气溶胶污染风险，未来应优化为一锅式封闭体系以提高生物安全性。此外，侧向层析灵敏度仍有提升空间，可通过优化报告探针或信号放大策略实现。尽管本研究样本量有限，但结果为EBV的分子筛查提供了可行概念验证，并为后续大规模临床验证奠定了基础。论文发表于《Frontiers in Microbiology》。