斑秃中免疫重塑的单细胞图谱提示MIF+成纤维细胞及其与树突状细胞的潜在配体-受体串扰

《Frontiers in Medicine》：Single-cell landscape of immune remodeling in alopecia areata suggests MIF?+?fibroblasts and their potential ligand-receptor crosstalk with dendritic cells

　　

摘要背景：斑秃（Alopecia areata，AA）是一种自身免疫性脱发性疾病。尽管自身反应性CD8⁺ T细胞是核心效应细胞，但基质与上皮区室在维持炎症中的作用仍不明确。

方法：本研究分析了GEO数据库中公开可得的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据（GSE212450、GSE233906），共纳入15份头皮样本，分别来自正常皮肤（normal skin，NS）、非皮损区（non-lesional，NL）和AA状态。经整合、标准化和聚类后，依据既有标志基因对细胞进行注释。进一步对子集中的免疫细胞、上皮细胞和成纤维细胞谱系进行再分群分析。差异表达分析与富集分析用于鉴定疾病相关基因和通路。采用CellChat比较NS与AA微环境之间的配体-受体相互作用及信号网络。

结果：scRNA-seq分析显示，AA皮损中的免疫生态位发生了深度重塑，这种重塑不仅限于免疫细胞，还累及上皮细胞与成纤维细胞。其关键特征包括淋巴系-髓系细胞扩增、克隆性细胞毒性CD8⁺ T1细胞积聚、肥大细胞减少，以及DC3来源的IL-15升高。尽管细胞比例总体稳定，上皮细胞仍表现出主要组织相容性复合体Ⅱ类（major histocompatibility complex class II，MHC-II）上调及免疫调节活性增强。研究鉴定出一种在AA中富集的新型促炎性成纤维细胞亚群（FB3），该亚群高表达巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF），呈现炎症与应激相关特征，并抑制细胞外基质组织。配体-受体分析发现，以MIF为中心的炎症回路明显增强，主要通过MIF-(CD74 + CXCR4/CD44)轴发挥作用，形成连接FB3与多个树突状细胞亚群的稳健信号网络。

结论：本研究揭示，AA皮损中的成纤维细胞，尤其是新鉴定的FB3亚群，并非仅为被动的结构性细胞，而是通过升高分泌MIF积极参与免疫炎症调控。增强的MIF-(CD74 + CXCR4/CD44)信号轴构成了连接FB3细胞与多个树突状细胞亚群的核心机制。该发现提示，靶向FB3分化或抑制MIF相关信号通路，可能成为AA的一种有前景的治疗途径。

本文发表于《Frontiers in Medicine》，围绕斑秃（Alopecia areata，AA）病灶微环境的细胞组成与细胞间通讯重塑展开系统分析。AA是一种以毛囊免疫豁免（immune privilege）崩溃为核心事件的免疫介导性疾病，临床表现为非瘢痕性脱发。既往研究主要强调自身反应性CD8⁺ T细胞在毛囊破坏中的致病作用，并已明确干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）及JAK-STAT信号参与病程推进。然而，AA为何容易复发、局部炎症微环境如何维持、除免疫细胞外的驻留细胞是否主动参与致病过程，仍缺乏充分解释。尤其是成纤维细胞、上皮细胞和先天免疫细胞在病灶局部的功能状态与相互作用，尚未被完整解析。因此，开展单细胞层面的微环境重构研究，对于突破传统“T细胞中心”认识框架、发现新的治疗靶点具有重要意义。

研究人员基于公开单细胞转录组数据，对AA、非皮损区（non-lesional，NL）及正常头皮（normal skin，NS）的细胞图谱进行了整合分析，重点考察免疫细胞、上皮来源细胞与成纤维细胞三大区室的转录重编程特征，并进一步通过配体-受体互作推断疾病相关的通讯网络。研究结果表明，AA病灶的炎症生态位并非仅表现为免疫细胞浸润增加，而是伴随上皮细胞免疫样转化以及特定促炎性成纤维细胞亚群的富集。尤其值得关注的是，研究鉴定出一种MIF⁺成纤维细胞亚群FB3，其通过MIF-(CD74 + CXCR4/CD44)轴与多类树突状细胞建立增强的信号连接，提示成纤维细胞在AA中具有主动调控炎症的作用。该结论扩展了对AA发病机制的理解，并为针对基质-免疫串扰的干预策略提供了依据。

研究采用的主要技术方法包括：整合GEO数据库两个公开scRNA-seq队列（GSE212450、GSE233906），共15例头皮样本，来源于NS、NL和AA三类临床状态；使用Seurat进行质控、SCTransform标准化、Harmony去批次效应、主成分分析（PCA）和UMAP降维聚类；对免疫细胞、角质形成细胞和成纤维细胞进行再分群；通过差异表达、GO/KEGG富集及基因集富集分析（GSEA）解析功能改变；利用CellChat比较NS与AA的细胞通讯差异；并通过免疫荧光对Vimentin⁺MIF⁺成纤维细胞及CD11c⁺CD74⁺树突状细胞进行组织学验证。

以下为论文结果部分的分项解读。

Integrated analysis unveils a pro-inflammatory niche in alopecia areata: overall lympho-myeloid expansion highlighting CD8 +T cells and diminished mast cells
研究人员首先对NS、NL和AA样本进行整合，获得76,727个高质量细胞，并识别出11类主要细胞谱系，包括角质形成细胞、黑素细胞、雪旺细胞、成纤维细胞、肌细胞、血管内皮细胞、淋巴内皮细胞、肥大细胞、淋巴样细胞、髓系细胞和B细胞。总体比较显示，AA病灶中淋巴样细胞和髓系细胞显著扩增，较NS增加约2.5倍，提示病灶形成了明显的促炎免疫生态位；而角质形成细胞和成纤维细胞在总体比例上未见显著差异。进一步对免疫区室进行高分辨率再聚类后，识别出15种免疫细胞亚群，包括M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞、cDC1、cDC2、DC3、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T1细胞、CD8⁺ T2细胞、调节性T细胞（Treg）、NK细胞、B细胞和浆细胞等。该部分结果显示，AA病灶中CD8⁺ T1细胞明显富集，而肥大细胞显著减少。与此同时，IL-15主要来源于DC3亚群，且在AA中表达进一步增强，提示DC3可能是维持病灶免疫激活的重要先天免疫节点。

Epithelial transcriptional signatures in alopecia areata: immune activation and stem cell dysregulation
在上皮区室，研究人员鉴定出7类角质形成细胞相关亚群：基底层角质形成细胞、增殖型角质形成细胞、棘层角质形成细胞、颗粒层角质形成细胞、毛囊角质形成细胞（HF）、毛囊干细胞（HFSC）和皮脂腺角质形成细胞。尽管AA与NS之间上皮细胞总体组成基本保持稳定，但其转录状态发生了明显改变。具体而言，基底层、棘层、颗粒层、HF和HFSC中MHC-Ⅱ相关基因HLA-DRA和HLA-DRB1显著上调，表明上皮细胞获得更强的免疫相关特征。与此同时，HFSC中干性标志基因LGR5和LHX2下调，提示毛囊干细胞稳态受损。炎症相关分子HLA-A、HLA-E、MIF、PLCG2和NUPR1在AA上皮来源细胞中升高。功能富集分析进一步显示，毛囊细胞激活了髓系细胞稳态、体液免疫应答和细胞因子产生调控等免疫相关过程，而未折叠蛋白应答、蛋白折叠及错误拓扑蛋白应答等蛋白稳态维持通路被抑制。这些结果共同说明，AA中上皮细胞虽未发生显著比例变化，却经历了由免疫豁免状态向炎症参与状态的功能转换。

Identification of a pathogenic, MIF-expressing inflammatory fibroblast subset
对基质区室的分析识别出5类成纤维细胞亚群（FB1-FB5）。其中，FB3亚群在AA病灶中显著富集，其特征是高表达CD44和MIF。研究进一步显示，PI16在各成纤维细胞亚群中普遍表达，而SCARA5主要富集于FB3和FB2，支持FB3的基质细胞属性。与其他成纤维细胞相比，FB3呈现强烈的促炎表型，上调CD44、CD59、MIF、B2M、NFKBIA、TNFAIP2、TNFAIP3和TNFAIP6等分子。基因集富集分析表明，AA来源的FB3同时出现免疫与结构功能的重塑：炎症反应、NF-κB信号、凋亡信号及活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢过程等通路增强，而细胞外基质组织相关通路下降，提示其从传统基质维持功能偏移为炎症信号放大功能。免疫荧光共染结果进一步证实，AA组织中成纤维细胞的MIF表达高于NS，且Vimentin⁺MIF⁺双阳性细胞比例显著增加。这一结果构成了FB3作为AA相关致病性促炎成纤维细胞亚群的直接支持。

MIF?+?fibroblasts act on dendritic cells via the MIF/CD74 axis
细胞间通讯分析显示，与正常头皮相比，AA中的FB3通过MIF信号通路与多种树突状细胞亚群及M1样巨噬细胞之间的互作显著增强。研究人员进一步分析MIF相关受体在不同细胞群中的表达模式，发现其主要受体CD74广泛分布于树突状细胞亚群，并在AA中明显上调，尤其在M1样巨噬细胞、cDC1、cDC2和DC3中最为突出。相比之下，替代受体CXCR4与CD44在各类细胞中表达较低且组间差异不明显，ACKR3几乎不可检测。进一步的配体-受体分析提示，FB3主要通过MIF-CD74 + CXCR4或MIF-CD74 + CD44轴作用于多类炎症细胞，其中树突状细胞是关键靶细胞。与其他成纤维细胞亚群相比，FB3与cDC1、cDC2、DC3及M1巨噬细胞之间的MIF相关互作增强更为明显，对整体MIF信号网络贡献更大。组织层面的免疫荧光染色也证实，AA病灶中存在CD11c⁺CD74⁺双阳性细胞，为成纤维细胞与树突状细胞之间的MIF介导串扰提供了原位证据。

讨论部分总结
论文讨论指出，本研究的核心贡献在于将AA的病理图景从单纯的适应性免疫异常扩展到包含上皮和基质共同参与的局部炎症网络。免疫层面，CD8⁺ T1细胞在病灶中的显著扩增再次支持其作为关键效应细胞的地位，而肥大细胞在高分辨率分析中的减少提示AA中先天免疫构成也存在动态失衡。上皮层面，毛囊干细胞功能受损与MHC-Ⅱ上调并存，说明毛囊相关上皮细胞不仅是攻击靶点，也可能主动参与炎症微环境塑造。基质层面，新鉴定的FB3亚群最具创新性，其表现出典型炎症型成纤维细胞特征，并伴随细胞外基质组织能力下降，显示AA中的成纤维细胞已发生功能极化。细胞通讯层面，FB3与树突状细胞之间以MIF为中心的信号联系显著增强，构成AA病灶中重要的基质-免疫串扰模块。论文同时强调，基于转录组的配体-受体推断本质上仍属相关性证据，尚不能确定因果方向；因此，FB3究竟是炎症的起始驱动者还是对炎症环境作出反应的放大者，仍需进一步功能实验验证。研究还指出，样本量较小且临床分型信息不足，是当前分析的主要局限。

研究结论翻译：
本研究揭示了AA的综合性细胞图谱，表明其炎症生态位不仅涉及免疫细胞，还包括上皮细胞和成纤维细胞。一项关键发现是在AA皮损中鉴定出富集的新型MIF⁺成纤维细胞亚群FB3。基于细胞间通讯分析，研究人员提出一个工作模型：FB3来源的MIF通过树突状细胞上含CD74的受体复合物传递信号，而树突状细胞进一步表达IL-15，这是一种对维持致病性CD8⁺ T细胞至关重要的细胞因子。然而，鉴于基于转录组的相互作用推断具有内在局限，所提出的FB3→树突状细胞→IL-15轴应被视为一种产生假说的模型。树突状细胞来源信号是否促进FB3表型形成，以及FB3成纤维细胞在疾病级联中究竟充当起始者还是放大者，仍有待未来直接功能验证。总体而言，这些发现拓展了AA的概念框架，使其不再仅被视为以T细胞为中心的疾病，并将FB3及MIF信号轴定位为潜在治疗靶点。