优化从黄瓜（Cucumis sativus）细胞外质中分离和鉴定胞外囊泡的方法

《Plant Biotechnology Reports》：Optimization of isolation and characterization methods for extracellular vesicles from Cucumis sativus apoplast

　　

摘要

细胞外囊泡（EVs）是各种生物系统中细胞间通信的关键介质，包括植物，在植物中它们有助于蛋白质、脂质和核酸的传递。虽然已经证明植物来源的细胞外囊泡（PDEVs）在模式物种的应激反应和宿主-病原体相互作用中具有内在功能，但从具有农业价值的作物（如黄瓜Cucumis sativus）的细胞外质（apoplast）中分离和鉴定这些囊泡的方法尚未得到优化。本研究评估并比较了现有的分离方案，以建立一种高效且标准化的从细胞外质洗涤液（AWF）中分离PDEVs的技术。我们直接比较了三种关键的分离方法：PEG沉淀、超速离心和尺寸排阻色谱（SEC），并根据成本、可扩展性、纯度以及囊泡的保存/完整性来评估它们的性能。透射电子显微镜（TEM）和免疫印迹分析揭示了分离出的囊泡的形态和蛋白质组特征，验证了每种方法所获得的囊泡完整性和标记物的富集情况。结果证实，尽管超速离心是分离的黄金标准，但它有可能损害囊泡的完整性。相比之下，PEG沉淀是一种低成本且可扩展的方法，尽管会同时沉淀可溶性蛋白质。我们证明了使用SEC作为关键的二次纯化步骤可以提高分离出的囊泡的纯度。总之，TEM和免疫印迹分析共同表明，基于SEC的纯化方法能够获得形态最完整且生化成分最丰富的囊泡。此外，我们还证明了AtTET8和AtPEN1抗体在黄瓜中的跨物种适用性，并验证了CsTET8作为与囊泡相关的标记物的有效性，这突显了标准化工作流程对作物PDEV研究的重要性。建立一种可靠且优化的分离方案是开展严格的功能研究以及发掘其在生物医学和可持续农业中潜在应用的基础。