一种结合计算机模拟与体外实验的新方法学用于肝脂肪变性化学物的早期检测

《Chemico-Biological Interactions》：A combined in silico and in vitro new approach methodology for early detection of liver steatogenic chemicals

　　

脂肪肝疾病是最普遍的肝脏病理改变，越来越多的证据表明化学物暴露可能参与其发生与发展。因此，阐明导致肝脂肪变性的扰动机制对于化学品安全评估至关重要。本研究提出了一种锚定于不良结局通路(AOP)网络的新方法学(NAM)，整合计算机模拟(in silico)与体外(in vitro)策略，以实现重复剂量暴露下肝脂肪变性化学物的早期识别。为此，研究人员选取7种参考肝脂肪变性化学物（包括3种药物：丙戊酸钠、盐酸四环素、盐酸胺碘酮；1种农药：环丙唑醇；3种增塑剂：磷酸三甲苯酯、全氟己烷磺酸、全氟辛酸）及2种非肝脂肪变性化学物（盐酸米诺环素、酒石酸），在3个浓度水平下评估其对肝脂肪变性相关分子起始事件(MIE)及关键事件(KE)的调控作用。配体激活转录因子的调控情况通过分层式计算机模拟工作流进行评估，该工作流结合了(定量)构效关系((Q)SAR)、read-across及分子对接技术。随后，利用人HepaRG肝细胞量化下游关键事件在转录及功能层面的变化，涵盖脂质蓄积、脂肪酸摄取、线粒体β氧化、脂质分泌、线粒体功能障碍、内质网应激及氧化应激。研究人员通过整合所有评估终点响应的生物学相关性及效应幅度，计算出每种化学物的肝脂肪变性评分。该评分可清晰区分肝脂肪变性与非肝脂肪变性化学物。综上，本研究证实了所建立的NAM在危害评估早期阶段识别化学物肝脂肪变性特性的潜力。

研究背景与意义

肝脂肪变性是药物及环境化学物诱导肝损伤的常见表型，约12%的肝毒性药物与其相关，严重时可进展为纤维化、肝硬化甚至肝癌。传统重复剂量毒性评价依赖啮齿类动物实验，存在物种差异大、预测人类低发生率不良事件能力不足等问题，且难以解析具体分子机制。近年来，替代动物实验的新方法学(NAM)成为毒理学研究热点，其核心是将计算机模拟、体外模型等技术与不良结局通路(AOP)框架结合，实现从分子起始事件到组织表型的机制驱动型风险评估。针对肝脂肪变性，目前尚缺乏整合多层级机制的NAM体系。基于此，研究人员依托已构建的肝脂肪变性AOP网络，开发了一种融合计算机模拟与体外实验的NAM，旨在为化学品肝脂肪变性危害的早期筛查提供标准化工具。

关键技术方法

研究采用9种参考化学物组成测试集，包括7种已知肝脂肪变性化学物与2种非肝脂肪变性同系物。计算机模拟部分建立三层分级工作流：第一层检索ChEMBL数据库获取实验结合数据；第二层整合(定量)构效关系((Q)SAR)、结构警报(SAR)及read-across分析，仅纳入适用性域内的可靠预测；第三层通过DockTox服务器执行分子对接，计算结合能评分(BES)与相互作用分数(IFS)并转化为对接评分(DS)。体外部分选用人HepaRG肝细胞模型，通过浓度响应实验确定亚细胞毒性浓度范围后，分两步开展检测：第一步采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析脂质代谢关键基因表达；第二步通过7项功能实验分别量化中性脂质蓄积、脂肪酸摄取、线粒体β氧化、载脂蛋白B(APOB)分泌、线粒体膜电位(MMP)、内质网应激及活性氧(ROS)水平。最终基于权重证据(WoE)框架，结合Bradford-Hill因果判定标准计算各关键事件的生物学合理性(BP)、必要性(ESS)与实证支持(EE)，整合计算机模拟概率与体外效应幅度生成肝脂肪变性总评分，并通过主成分分析(PCA)验证分类效能。

研究结果

3.1 分子起始事件的计算机模拟预测

三层工作流共完成77组化学物-受体组合预测。结果显示，非肝脂肪变性对照物酒石酸与米诺环素均被判定为核受体非结合剂；丙戊酸钠无明确受体结合活性；四环素除核因子红细胞2相关因子2(NRF2)外均为非结合剂；环丙唑醇与胺碘酮多数受体结合预测为阴性；磷酸三甲苯酯的3种组分中至少一种对过氧化物酶体增殖物激活受体α/γ(PPARα/γ)、孕烷X受体(PXR)、肝X受体α/β(LXRα/β)呈结合或潜在结合状态；全氟己烷磺酸仅对PXR显示结合活性，全氟辛酸未获明确结合证据。

3.2 关键事件的体外模型验证

细胞活力测试确定各化学物亚毒性浓度范围后，转录分析显示：所有肝脂肪变性化学物均显著上调脂肪酸摄取蛋白CD36表达（全氟辛酸在中浓度即生效）；过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)与肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)在四环素、全氟系列化学物中上调，丙戊酸钠则下调；甘油三酯合成关键酶二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)与硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)仅在少数化学物中显著改变；载脂蛋白B(APOB)在丙戊酸钠与环丙唑醇处理下下调。功能实验进一步证实：6种肝脂肪变性化学物（除全氟己烷磺酸外）在高浓度诱导显著脂质蓄积；脂肪酸摄取增强见于丙戊酸钠、四环素、磷酸三甲苯酯、全氟系列化学物；线粒体β氧化受胺碘酮、磷酸三甲苯酯、全氟己烷磺酸激活，而被丙戊酸钠抑制；脂质分泌受丙戊酸钠、磷酸三甲苯酯、环丙唑醇、四环素抑制；线粒体功能障碍表现为胺碘酮、全氟辛酸降低线粒体膜电位，环丙唑醇与磷酸三甲苯酯升高膜电位；内质网应激仅由四环素与磷酸三甲苯酯诱导；氧化应激由丙戊酸钠、环丙唑醇、全氟辛酸触发。非肝脂肪变性化学物中，米诺环素意外显示脂质蓄积，但无其他肝脂肪变性特征性通路改变；酒石酸则表现出抗脂肪变性特征。

3.3 权重证据评分体系的建立

研究人员将各终点的生物学贡献度与效应强度整合为总WoE评分。仅基于体外数据时，肝脂肪变性化学物评分范围为6.32至14.64，非肝脂肪变性化学物为0.32至5.05；整合计算机模拟数据后，前者提升至7.35至21.35，后者维持在1.39至5.05，组间分离度进一步提高。主成分分析显示，高浓度肝脂肪变性化学物与低浓度组及非肝脂肪变性化学物形成明显聚类，证实该评分体系可有效区分肝脂肪变性危害。

讨论与结论

本研究首次构建了锚定于AOP网络的肝脂肪变性NAM，解决了既往体外模型机制覆盖不全、计算机模拟预测与功能证据脱节的问题。计算机模拟三层工作流虽对部分非药物类化学物预测存在局限，但通过整合多源数据提高了可靠性；体外测试电池覆盖了从转录调控到细胞功能的完整通路，揭示了不同化学物致肝脂肪变性的异质性机制，如丙戊酸钠主要通过抑制脂质分泌与β氧化致病，而全氟辛酸则通过增强脂肪酸摄取与线粒体损伤发挥作用。权重证据评分体系成功实现了多维度数据的半定量分析，为化学品肝脂肪变性危害分类提供了可量化的依据。该研究发表于《Chemico-Biological Interactions》，其建立的NAM可作为化学品高通量筛查的工具，后续需在更大独立化学物集合中验证预测效能，并进一步优化三维细胞模型以提升对适应性反应与不良结局的区分能力。