基因组编辑工具能够实现脱氧核糖核酸（DNA）的精准、高效修饰，已在作物改良和基础植物科学研究中取得了突破性进展。然而，常规基因组编辑可能导致非预期基因片段整合到宿主基因组中，同时伴随脱靶效应以及抗性基因遗传漂移的风险。相比之下，无转基因成分基因组编辑（transgene-free genome editing）是一项革命性突破，其优势在于：1）通过无DNA或瞬时递送规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）组分，实现精准、稳定的基因组修饰，同时最大程度减少外源DNA整合；以及2）将核糖核蛋白复合物（RNPs）或信使核糖核酸（mRNA）递送至宿主内。在本综述中，研究人员探讨了无转基因成分基因组编辑技术的核心原理，包括RNPs的直接递送、mRNA递送系统、利用胞嘧啶或腺嘌呤碱基编辑器（CBEs, ABEs）进行单核苷酸的精准替换，以及利用模板进行逆转录的多种先导编辑（prime editing）机制。这些技术推动了不含外源RNA的作物的发展，这类作物被认为是非遗传修饰生物。最后，研究人员讨论了未来前景，包括将递送系统与人工智能辅助优化相结合的无转基因成分基因组编辑工具的开发，及其在农业中的广阔应用前景。
1. 引言
基因组编辑能够在宿主基因组的特定位点产生靶向遗传改变，如碱基替换以及小片段的插入/缺失。植物中的基因组编辑促进了基因功能基础研究及作物性状改良。在常规基因组编辑过程中，植物基因组DNA中产生双链断裂（DSBs），随后细胞的修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），被利用来进行基因修饰。然而，利用常规农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的基因组编辑进行DNA载体递送，可能导致农杆菌T-DNA的稳定整合，这使得"无转基因成分"编辑以规避监管限制变得复杂。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统的出现作为强大且易获得的平台，彻底改变了基因组编辑领域。例如，农杆菌介导的Cas9和CRISPR组分瞬时表达结合快速、高通量筛选，使得非转基因编辑植株的恢复无需依赖编辑与转基因的性分离。
无转基因成分基因组编辑因其能够在没有外源DNA稳定整合的情况下产生靶向遗传改变，正越来越多地应用于作物改良。RNPs的成功递送标志着无转基因成分编辑迈出了重要的第一步。通过直接递送预组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物或编码Cas9/sgRNA的mRNA（而非DNA表达盒），编辑组分发挥瞬时作用并通常在编辑后被清除，从而最大程度降低外源DNA稳定整合到宿主基因组的风险。与此同时，碱基编辑器（base editors）和先导编辑器（prime editors）等精准编辑工具扩展了超越DSB依赖修复的无痕修饰范围，实现了靶向替换和更广泛的序列改变。无转基因成分编辑需求的增长源于各领域实际挑战。在农业生物技术中，无转基因成分编辑作物通常可以规避与转基因相关的严格监管，从而加速这些作物的商业化，因其缺乏外源转基因组分。在生物医学和基础研究领域，用于外源基因即时表达的编辑系统降低了脱靶效应和基因组持续突变的风险，从而缓解伦理关切并满足安全标准。无转基因成分作物的开发已取得实质性进展，特别是在增强抗逆性方面。然而，技术瓶颈仍然存在，包括编辑效率低、缺乏稳定的递送系统以及大片段基因组的精准编辑困难。
常规农杆菌介导的转化通常以T-DNA表达盒形式引入CRISPR/Cas9组分，随后进行筛选和再生以获得编辑植株。由于T-DNA主要在基因组中随机插入，稳定转化可能引入非预期的基因组破坏和插入位点不确定性，这可能使下游分析和育种复杂化。相比之下，无转基因成分基因组编辑方法旨在避免外源DNA的稳定整合并限制编辑器活性持续时间，与基于DNA载体的稳定转化相比，可减少整合相关的基因组破坏并简化下游解读。通过直接递送RNP复合物或mRNA，无转基因策略可以减少整合相关的基因组干扰，并允许瞬时编辑器活性在编辑后被消除，这对于碱基编辑和先导编辑等精准工具尤为重要。除了无DNA递送外，也可使用瞬时表达流程，即在可控条件下临时表达编辑盒而不持续保留于基因组中，从而产生具有最少残留外源DNA的编辑植株。因此，无转基因工程的核心焦点是在编辑活性与可验证的非外源DNA整合之间取得平衡，而非孤立优化递送参数。
确保最终编辑植株不保留任何外源DNA序列的方法有多种，包括使用无DNA递送系统、瞬时表达，或稳定转化后通过遗传分离或程序性消除转基因元件。在本综述中，研究人员总结了瞬时策略和多样化递送系统的进展，并简要概述了通过稳定转化实现无转基因成分编辑的关键途径和代表性筛选方法。
2. 先导编辑和单碱基编辑用于无转基因成分基因组工程
2.1 先导编辑
先导编辑（PE）的开发旨在将精准基因组工程拓展到常规碱基编辑器实现的单碱基替换之外，实现更广泛的微小序列改变，包括替换、插入和缺失。核心先导编辑系统由Cas9切口酶变体与逆转录酶（nCas9-RT）的融合蛋白，以及包含间隔序列、引物结合位点（PBS）和逆转录模板的前导编辑向导RNA（pegRNA）组成。先导编辑器（PEs）在不引入DSB的情况下产生所需编辑。PE1-PE3是常用的PE系统。PE1将nCas9-M-MLV RT与pegRNA配对，在不同植物物种和不同pegRNA设计中表现不一。PE2采用M-MLV RT变体改善编辑效果，而PE3还添加第二个切口sgRNA以偏向编辑链的修复，从而提高编辑效率。PE3系统被用于编辑模式苔藓Physcomitrium patens中调控配子体滋养层和芽发育的Defective kernel 1（PpDEK1）基因，编辑效率高达1.5%，促进了高效突变体生成。PE系统也已在稻（Oryza sativa）和小麦（Triticum aestivum）中成功实现高效基因组编辑。然而，PE介导的基因组编辑的效率和可重复性在不同物种和位点间存在显著差异。优化调控元件和载体设计已被探索以改善包括双子叶植物在内的植物中的编辑效果。携带双pegRNA载体的PE3构建体已被用于编辑花生（Arachis hypogaea）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）和豇豆（Vigna unguiculata）等豆科植物的绿色荧光蛋白（GFP）基因，总体编辑效率为0.2-0.5%。先导编辑还可与可筛选/代理位点（如乙酰乳酸合酶ALS相关等位基因赋予的除草剂抗性）相结合，以促进编辑事件的富集和恢复，这对无转基因成分流程尤其有用。重要的是，通过瞬时递送也已一步生成无转基因成分的先导编辑水稻植株。
2.2 碱基编辑
碱基编辑用于在特定位点创建靶向碱基转换，无需供体DNA且通常不诱导DSB，使其成为植物中精准等位基因工程的实际途径。常见平台包括胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）、腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和C-to-G碱基编辑器（CGBEs），主要区别在于用于靶向特定碱基进行修饰的脱氨酶/修复模块。这些编辑器扩展了特定序列精准编辑的范围，但其适用于无转基因成分工程的关键在于递送方式、回收方法以及验证其不整合入宿主基因组。
使用无DNA或瞬时系统的一个关键挑战是缺乏持续选择压力。因此，研究人员利用内源性可筛选位点来富集编辑事件，无需引入抗生素或荧光标记基因。ALS作为广泛使用的代理位点，因为ALS抑制性除草剂阻断支链氨基酸生物合成，而ALS的特定位点突变赋予除草剂抗性。CBEs已被用于引入除草剂抗性等位基因并促进编辑再生体的富集，从而在早期世代产生无转基因成分植株。类似地，CBE介导的花生AhALS2编辑产生AhALS2
P197S等位基因，以3.5%的编辑效率产生除草剂抗性植株，且未检测到脱靶效应。这些例子说明可筛选/代理位点如何部分补偿瞬时递送系统中有限的选择压力。
单碱基编辑已在多项研究中被广泛应用。碱基编辑器CBE3和CBE4已广泛用于杂交杨、番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、水稻、小麦和玉米（Zea mays），在马铃藨中编辑效率高达64%。基于SpCas9的系统进行高效碱基编辑通常需要靶位点附近存在规范的原间隔序列邻近基序（PAM），这限制了其广泛应用。研究人员开发了采用SpCas9-NG变体的新型ABE，该变体识别NG PAM序列，从而克服了对规范NGG型PAM的严格依赖。这一进展使水稻OsSPL17位点的A-to-G替换成为可能，其中NG、NAG和NGCG PAM序列均可被SpCas9-NG变体识别。SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE 17（OsSPL17）位点的编辑效率达到74.3%，显著扩展了水稻碱基编辑的靶标范围。此外，CGBEs的引入促进了编辑位点的多样化。通过优化来源于人UNG、大肠杆菌UNG和分枝杆菌Uracil DNA glycosylase X（UDGX）的三种尿嘧啶-N-糖基化酶的密码子使用，新型CGBE载体实现了水稻中高效的C-to-G编辑，效率高达45.9%。
3. 原生质体介导的再生用于无转基因成分基因组编辑
农杆菌介导的遗传转化可通过多种方法进行，包括叶盘法、真空浸润法和共培养法。一旦CRISPR组分的递送和基因组编辑完成，获得编辑植株便成为关键问题。转基因细胞可从幼嫩组织或编辑的外植体中选取，在无菌条件下用酶溶液消化细胞壁，混合物经滤过和离心收集原生质体。原生质体在培养约一周内开始再生细胞壁，约三周内可形成肉眼可见的细胞团。将再生的细胞团转移至分化培养基并选择健康愈伤组织后，使用适当培养基诱导芽和根再生，通过器官发生或体细胞胚胎发生获得完整植株，具体取决于物种和方案。一段时间的开口瓶炼苗后，植株可移栽繁殖。
为克服复杂、昂贵的组织培养程序，无组织培养转化方法应运而生。常见的无组织培养技术包括微粒轰击、电穿孔、花浸法、花粉管通道和胚性组织感染。通过嫁接进行基因组编辑和利用发根农杆菌诱导编辑根的切-浸-芽接（CDB）方法提供了无组织培养基因组编辑途径；然而，需要额外步骤确保再生枝条不含整合的T-DNA序列。
无组织培养转化方法的进步将大大简化转化，从而减少转化周期数并提高转化效率，为分子育种和遗传研究奠定基础。此外，可通过可诱导的位点特异性重组系统（如Cre/loxP或FLP/FRT）将基因组编辑组分的去除整合到再生流程中，这些系统可在所需突变引入后精确切除整合的编辑盒。该策略已成功用于多种葡萄（Vitis vinifera）和苹果（Malus domestica）品种的基因组编辑。
4. 无转基因成分基因组编辑的多种递送系统
4.1 mRNA和RNP递送系统
mRNA递送是实现无转基因成分基因组编辑的相对简单有效的方法。该方法将编码基因组编辑工具（如Cas9或碱基编辑器）的mRNA递送至宿主细胞，而非使用质粒。mRNA通过体外转录（IVT）合成，通过脂质纳米颗粒（LNPs）、微粒轰击或其他方法直接进入细胞，并由核糖体直接翻译成蛋白质。迄今为止，mRNA递送已用于编辑小麦的ALS、TaGASR7等基因，最大编辑效率达26.2%。这些mRNA及其衍生蛋白质被及时降解以防止对靶位点持续产生影响。然而，体外转录的Cas9 mRNA由于转录本长度和二级结构的差异，在体内的稳定性和翻译效率可能变化，导致与向导RNA共递送时编辑结果不一致。
v2_TMV/DEN2是一种最近开发的mRNA递送系统，代表了提高mRNA递送效率的新方法。通过优化体外转录mRNA的5'非翻译区（5' UTR）和poly(A)尾，并在微粒轰击过程中采用漆黄素包裹，在水稻悬浮细胞和不成熟小麦胚胎中实现了A-to-G和C-to-T碱基编辑。漆黄素包裹通过保护转录本免于降解并促进细胞摄取来增强微粒轰击过程中mRNA的稳定性，从而提高翻译效率和总体编辑效果。该系统的效率比常规质粒递送系统提高了4.7倍。此外，植株内微粒轰击（iPB）是一种新的小麦转化技术，通过直接轰击种子胚茎尖的分生组织来缩短基因组编辑所需时间，无需抗生素介导的愈伤组织筛选和植株再生。尽管mRNA递送已在几种单子叶植物中成功实施，但其在其他植物物种中的应用仍具挑战性。
RNP递送有助于克服不同植物中无痕编辑的普遍挑战。RNP递送系统不需要转录或翻译。Cas9和单链sgRNA被预组装成RNP复合物，然后通过物理或化学方法引入植物细胞。基因组编辑后，RNPs被快速降解，在实现靶位点修饰的同时最大程度降低脱靶效应的可能性。Cas9-sgRNA RNPs demonstrated与基于质粒的表达系统相同的高编辑效率。将RNPs递送至细胞的常用方法有三种：原生质体递送系统、微粒轰击和病毒载体。
4.2 RNP向原生质体的递送
使用RNPs在细胞中进行瞬时表达是生物学中广泛使用的技术。然而，与动物细胞不同，植物细胞具有天然的物理屏障——细胞壁，需要采用不同方法将生物分子引入这些细胞。促进原生质体中基因组编辑试剂递送的主要组分包括聚乙二醇（PEG）、细胞穿透肽（CPPs）、脂质体和电穿孔。
原生质体研究中最常用的递送策略是PEG介导法。该方法通过酶法去除细胞壁获得原生质体，随后通过PEG介导转染引入CRISPR组分，在原生质体中实现靶向编辑。2015年，首次在水稻、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）和莴苣（Lactuca sativa）原生质体中证明了基因组编辑。莴苣bin2突变体以高达46%的比率再生，且在任何突变体中未检测到脱靶突变。BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）编码油菜素内酯信号通路中的负调控因子。PEG介导的RNP复合物递送也在葡萄、苹果、矮牵牛（Petunia × hybrida）和马铃薯中得到证实。莴苣原生质体可产生转基因植株，实现高达99%的卓越编辑效率。这一高效率使得莴苣叶绿体基因的精准定点突变成为可能，极大促进了基因功能的深入研究。此外，核酸酶Cpf1（也称为Cas12a）已被纳入植物RNP编辑工具箱。LbCpf1/CRISPR RNA（crRNA）和AsCpf1/crRNA RNPs被成功引入大豆（Glycine max）原生质体，靶向两个同源基因FATTY ACID DESATURASE 2-1A（FAD2-1A）和FAD2-1B，以提高大豆油中的油酸含量。受精卵已被用于通过PEG改善植物性状。研究人员在体外刺激水稻精子和卵细胞分离产生无细胞壁的合子，然后将CRISPR/Cas RNPs引入细胞，用于产生基因组编辑的合子。编辑的合子发育成植株，其编辑稳定遗传。
脂质体介导的原生质体CRISPR/Cas元件转染与PEG介导转染类似。但与PEG方法不同的是，脂质体方法利用植物细胞膜的特性相对温和地递送外源物质。脂质体通过静电结合封装RNPs并通过内吞作用促进其进入细胞，与细胞膜特性更匹配。脂质体在递送至细胞后自动解离，支持RNP活性。单独使用脂质纳米颗粒作为转染试剂最近已在葡萄中得到证实。该方法规避了脂质体与PEG结合对细胞活力的负面影响，在编辑易感性基因以减少该作物农药使用方面显示出前景。不同类型脂质体递送基因组编辑试剂的效率不同。Lipofectamine 3000和RNAiMAX的递送效率分别为66%和48%。用这些系统靶向产生荧光蛋白的转基因烟草原生质体，产生了6%的定向诱变率，扩展了脂质体转染的潜在应用。
CPPs是生物分子的高效递送系统。CPPs最初称为蛋白转导结构域（PTDs），富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸，通常由少于30个氨基酸残基组成。与脂质体类似，CPPs通过直接穿透或内吞作用递送至植物细胞，从而跨植物细胞壁和细胞膜将生物分子转运至原生质体。CPPs的直接穿透（如HIV来源的TAT肽）通过破坏脂质排列产生瞬时孔，而内吞作用介导的CPP穿透（如Penetratin）则通过网格蛋白介导的内吞作用进行内体逃逸转位。最终，CPPs被内源性细胞蛋白酶降解。CPPs可与蛋白质结合实现无痕编辑。例如，锌指核酸酶（ZFN）-CPP复合物被成功用于将基因组编辑组分递送至小麦细胞，有效编辑了Inositol pentakisphosphate 2-kinase 1（IPK1）基因，有望降低植酸含量并提高饲料营养价值。CPP递送效率在不同植物物种间存在差异。在测试的CPPs中，阳离子dR9（由两个九精氨酸肽组成）是在拟南芥、大豆和番茄叶片中喷洒用各种CPPs标记的TAMRA（5-羧基四甲基罗丹明）染料时最高效的转运体。通过筛选CPPs和各种可电离阳离子脂质，脂质纳米颗粒（LNP）制剂最近得到优化，进一步提高了ABE和PE的递送效率。
电穿孔是一种利用短时高压脉冲电场（100-1,000 V/cm，数毫秒）使细胞膜脂质双层极化，形成纳米级亲水孔的高效递送技术。该过程包括三个阶段：1）电容充电发生，导致电场驱动离子迁移和跨膜电位差超过临界阈值（约1 V）；2）磷脂分子重排形成瞬时孔，促进递送；3）撤除电场，孔因膜流动性而自修复。必须优化多个参数以确保电穿孔成功。通过电穿孔以50 V/cm场强将Cre重组酶引入烟草细胞，成功编辑了含有GFP并由loxP序列侧翼的大片段，证实了在最佳条件下电穿孔可诱导靶DNA序列重组的假设。选择适当的电穿孔系统和植物组织不容忽视；例如，Neon电穿孔系统被用于编辑大豆原生质体中的组成型病原反应5（CPR5）基因，最大效率达到8.1%。来源于三出复叶的原生质体被证明对电穿孔介导的转化最有效。
4.3 微粒轰击
微粒轰击是大多数作物基因转移的首选方法。该方法通常使用氯化钙（CaCl
2）和多胺化合物（如原胺）包裹微米甚至纳米级的金或钨颗粒。基因枪提供的高压气体（通常为氦气或氮气）加速这些金属颗粒穿透植物细胞壁和质膜，将蛋白质和DNA等大分子直接递送至细胞质或核区。进入细胞核的外源DNA可通过NHEJ或同源重组（HR）整合到基因组中，导致稳定遗传转化。即使DNA未整合，高效的瞬时基因表达仍可实现。该技术常用的靶组织包括愈伤组织、未成熟胚和其他具有强再生能力和活跃细胞分裂的材料。由于微粒轰击不依赖植物对农杆菌的敏感性，它广泛适用于杨树和其他重要树种。
微粒轰击介导的RNP复合物向植物细胞的递送需要体外组装含Cas的RNP复合物。这些复合物随后用金粉包裹递送至植物细胞。该技术被用于编辑玉米的ALS2和雄性育性基因（Male sterility 26 [MS26], MS45），再生玉米植株中的编辑频率为2.4%至9.7%。通过微粒轰击使用靶向这两个基因的RNP复合物，在未成熟小麦胚中成功编辑了粒重基因TaGW2和粒长基因TaGASR7，产生了无转基因成分编辑植株。此外，靶向TaGASR7和TaDEP1的CRISPR/Cas瞬时表达载体通过微粒轰击成功引入小麦愈伤组织，在分化和植株再生后产生了矮秆表型的基因编辑植株。
纳米技术因其高度可调的物理化学特性和优异的生物相容性，已成为无痕基因组编辑的强大工具。纳米材料的主要优势包括可控尺寸（通常小于100 nm）、大比表面积和易于表面功能化。这些特性使其能够高效装载CRISPR/Cas组分（Cas9、sgRNA和供体模板）并在特定细胞或组织中可控释放。常见纳米材料类型包括金属纳米颗粒（如金和银）、可生物降解聚合物（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物[PLGA]）、LNPs、碳纳米材料（包括碳点和碳纳米管）和DNA折纸（自组装的纳米级核酸结构）。重要的是，小纳米颗粒（<100 nm）具有优异的细胞穿透能力，消除了传统颗粒相关的强物理冲击和膜破裂风险，适用于原生质体、愈伤组织等脆弱结构的植物材料。直径50 nm的层状双氢氧化物（LDH）纳米颗粒被用于将双链RNA（GUS-dsRNA）递送至发育中的番茄花粉细胞，无需物理辅助或化学处理。处理后3天，GUS转录本水平下降了89%，确认了编辑系统的成功递送。
金纳米颗粒因其低毒性而经常被用作微粒轰击中传统微米级金颗粒的替代物。该方法显著降低细胞毒性和脱靶效应风险，同时保持有效穿透。使用DNA包裹的金颗粒将pCCR2-CRISPR质粒引入杨树组织以编辑CINNAMOYL-CoA REDUCTASE 2（CCR2），编辑效率高达34.3%。获得了若干无转基因成分基因编辑植株。可生物降解聚合物如PLGA可以减缓基因组编辑元件的释放并延长表达时间窗口，从而提高编辑效率。相比之下，DNA折纸允许CRISPR/Cas9系统通过预设计的空间构型响应特定生物信号（如microRNA丰度水平）在靶位点精确释放编辑器。这种方法可通过优异的细胞选择性和时空可控性提高编辑效率。此外，碳纳米材料因其优越的细胞穿透能力和非整合表达特性，广泛用于原生质体和组织的瞬时表达，适用于无痕编辑。单壁碳纳米管（SWNTs）也被用作纳米载体，因其可非共价吸附小干扰RNA分子于表面，在烟草中实现了高达95%的GFP沉默效率。
纳米材料的功能化修饰是基因递送的重要方法。通过在纳米颗粒表面偶联特定肽链、抗体或糖配体，可以显著增强对特定细胞类型的识别和结合效率。此外，封装pH响应性或酶响应性涂层的设计允许纳米颗粒在特定细胞内环境中快速释放，从而最小化非靶细胞编辑和脱靶效应。例如，microRNA响应性纳米胶囊仅在miR-21积累位点释放Cas9，实现了靶向和编辑精度的协同提升。光和磁响应纳米材料也可能适用于基因递送。利用近红外光和磁场等外部刺激，可以精确调控基因释放的时间和位置，这尤其适用于需要组织特异性或阶段特异性表达的植物发育调控研究。纳米技术在植物基因递送和无转基因成分编辑中具有巨大潜力。
4.4 病毒感染
具有RNA基因组的植物病毒也适用于实现植物中的无转基因成分编辑，因为病毒颗粒瞬时表达且其基因组非整合。基于烟草脆裂病毒（TRV）的系统递送紧凑型RNA引导基因组编辑器，成功用于拟南芥的一步法无转基因成分生殖系编辑，产生可遗传编辑，凸显了病毒介导递送超越体细胞组织的潜力。单链RNA病毒可分为正链病毒和负链病毒。正链病毒依赖自我编码的RNA聚合酶（RdRP）进行复制，其转录本由宿主核糖体直接翻译产生病毒蛋白。由于它们有限的承载能力和遗传过程中的不稳定性，递送长核酸序列时常发生片段的插入或缺失。因此，正链病毒通常用于将CRISPR/Cas系统的一些组分（通常是sgRNA）引入表达Cas的转基因受体，从而实现植物基因组编辑。该方法已在小麦和烟草中使用大麦条纹花叶病毒（BSMV）和TRV递送载体得到验证，促进了sgRNA直接递送至两种物种的生殖细胞或分生组织细胞，无需组织培养，在来源于Cas9表达转基因植株的种子中产生可遗传基因组编辑，随后可通过遗传分离获得无Cas9转基因的后代。最近，基于RNA病毒的递送在小麦中实现了无转基因成分且无组织培养的可遗传基因组编辑，为再生仍是主要限制因素的单子叶作物提供了概念验证。此外，VITF-Edit技术被成功用于将BSMV-sg感染的Cas9表达转基因小麦花粉与野生型小麦杂交，产生了Cas9转基因突变体。
负链RNA病毒表现出强基因组稳定性和显著的承载能力，因为其线性核衣壳在复制过程中保持被包裹状态，防止基因组重组。在最近设计的系统中，某些负链RNA病毒已被证明可容纳完整的CRISPR/Cas模块，从而消除了对表达Cas9的转基因植株的需求，实现了无外源DNA稳定整合入宿主基因组的瞬时基因组编辑。负链RNA病毒广泛用于各种植物物种的无转基因成分编辑。番茄斑萎病毒（TSWV）载体的构建是一项重大突破。基于TSWV的农杆菌浸润构建体后，番茄、甜椒（Capsicum annuum）等作物的基因组被编辑，在番茄中实现了78.2%的令人印象深刻的编辑效率。此外，将CRISPR/Cas模块插入负链RNA病毒菊苣黄网病毒（SYNV）的N和P基因之间，导致烟草中Phytoene synthase（PDS，编码类胡萝卜素生物合成的关键酶）的编辑，产生白化表型，单靶点编辑的突变频率达到91%。最后，病毒载体与碱基编辑器结合的编辑越来越受到关注。重组TSWV载体已被用于递送CBEs和ABEs以在辣椒、花生等作物中进行编辑。CBE和ABE的转换效率分别为29.4-60.8%和12.8-25.2%，成功将单碱基编辑与病毒载体相结合。
5. 筛选方法
持续选择压力的存在与否是评估基因组编辑递送策略是否适合产生无转基因成分植株的关键因素。用于植物基因组编辑的CRISPR试剂有三种常见类型：基于DNA的CRISPR/Cas9载体、RNA分子和RNP复合物。基于DNA载体的递送系统在选择方面具有明显优势，因为赋予抗生素抗性或编码荧光报告子的可筛选标记基因可整合到载体骨架中。在组织培养过程中使用适当的选择剂可富集携带编辑组分的细胞，从而大大提高编辑植株的有效回收率。
稳定转化后无转基因成分基因组编辑植株的分离通常需要将CRISPR编辑构建体与可筛选标记基因一起递送至受体植物基因组，最常通过农杆菌介导转化，随后通过有性繁殖后的遗传分离回收无转基因成分编辑植株。然而，常规鉴定方法需要PCR扩增和基因分型，劳动密集且耗时。
已开发多种策略来提高稳定转化后鉴定无转基因成分个体的效率。这些方法大致可分为被动富集策略和编辑后主动消除系统。被动富集策略包括视觉信号辅助筛选和基于生长的筛选。荧光标记系统通常将编码DsRed或GFP等荧光蛋白的基因整合到CRISPR载体中，允许在T0代幼苗或愈伤组织或其衍生的T1代种子中快速识别候选无转基因成分个体。然而，这些系统需要专门的荧光检测设备，且荧光信号通常对种皮的穿透有限。基于色素的筛选也被探索。RUBY系统使用植物中广泛存在的代谢物酪氨酸作为底物转化为红色色素甜菜红素，适用于多种植物物种。但多个基因的组装需求增加了载体构建的复杂性，且色素积累可能受环境条件或发育阶段影响。
基于生长的筛选依赖于对选择剂的差异抗性或敏感性。处理产生携带编辑构建体植株与缺失构建体植株（经分离后）之间的表型差异，通常涉及不同的存活率或生理反应。该方法的有效性常取决于植物的遗传背景，且可能对植物造成胁迫。例子包括水稻中的CRISPR S系统，其结合靶向细胞色素P450基因CYP81A6的RNA干扰盒，该基因赋予除草剂杀草丹耐受性；保留转基因构建体的植株保持杀草丹耐受性，而缺失构建体的分离体变得敏感，从而实现对转基因个体的负筛选；拟南芥中使用PARAQUAT RESISTANT 1（PAR1）作为可筛选标记，用百草枯处理进行单世代筛选；以及水稻系统采用瞬时潮霉素处理后3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色，基于过氧化氢积累差异区分个体。
尽管被动富集策略可以缩短获得无转基因成分个体所需时间，其理论分离频率仍然有限。在二倍体基因组单插入的理想情况下，无转基因后代预期比例约为25%。为克服这一限制，已开发编辑后主动消除系统。
转基因杀手CRISPR（TKC）系统采用由RICE EMBRYO GLOBULIN 2（REG2）启动子等驱动的BARNASE细胞毒模块，选择性消除携带转基因的配子或胚胎，从而降低其传递可能性。然而，已有低频逃逸事件的报道。改进版本TKC2整合了RUBY报告模块以实现转基因组织的视觉识别，以及设计用于选择性去除转基因阳性配子或胚胎的多阶段自动消除模块。使用该系统的无转基因成分后代回收效率接近100%。尽管如此，该系统的强致死效应可能限制跨连续世代的编辑并增加部分编辑或嵌合风险。
荧光标记和花粉杀手CRISPR（FMPKC）系统将荧光蛋白DsRed2与花粉特异性细胞毒模块结合，通常由配子体特异性启动子驱动表达致死基因如barnase，从而选择性消除携带转基因的花粉。该设计实现视觉分离同时保留一部分携带编辑组分的种子，增加获得完全编辑并最终无转基因成分植株的概率。然而，该系统的更广泛适用性可能受物种间配子特异性启动子活性差异的限制。此外，该系统对于育种周期长的木本植物仍然具有挑战性。
基于RNA和RNP的递送系统依赖瞬时基因表达且不涉及基因组整合。这些系统消除了稳定维持可筛选标记基因表达的需求，最终导致普遍缺乏有效选择压力。为解决这一局限，已开发两种主要筛选策略：基于分子检测的筛选和基于PDS的共编辑策略。分子检测方法不依赖标记基因，而是直接使用分子技术（包括限制性酶切、靶向深度测序和高分辨率熔解分析）鉴定编辑事件。然而，这些方法需要对每一株再生植株或细胞克隆进行核酸提取、PCR扩增和序列验证，这种劳动密集、耗时的程序不适合突变体群体的大规模筛选。
基于PDS的共编辑提供了有效的替代筛选策略。PDS编码类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶，在植物物种中高度保守；功能缺失突变通常导致白化表型，为编辑事件提供了视觉指示。实践中，靶向PDS的编辑试剂（RNA或RNP）可与靶向目的基因的试剂共递送，通过表型预筛选和分子验证两步法快速鉴定双阳性编辑植株。随后通过自交或回交的遗传分离恢复野生型PDS等位基因，最终仅产生携带目的基因所需编辑的植株。由于PDS是内源性植物基因，该筛选策略避免了外源标记基因的引入，从而减少了与转基因方法相关的监管担忧和公众顾虑，符合无转基因成分基因组编辑的实际目标。
6. 结论与展望
无转基因成分编辑可被视为一种基于证据的流程级结果。本综述的核心信息是，成功的无转基因成分编辑较少取决于任何单一编辑器，而是取决于端到端流程能否在再生限制下反复产生分子清洁、可遗传的基因型。在表1总结的主要无转基因成分编辑途径中，一个一致的权衡出现：操作上可控且高效的递送系统可能增加对分子足迹和模糊结果的担忧，而更瞬时的、最小化足迹的策略往往将负担转移到下游，表现为植物再生限制、不同基因型间的可变结果以及直接挑战可扩展性的更重筛选需求。新兴递送技术拓宽了技术上可能实现的范围，但其价值最终将取决于标准化、可预测性和严格验证的能力，而非仅取决于新颖性。因此，将无转基因成分流程设计为集成系统至关重要，将递送与内置富集/筛选配对，扩展基因型稳健的再生平台，并采用协调的分子验证和多代稳定性基准。这些步骤将使"无转基因成分"成为育种和部署的可重复结果，而非孤立的概念验证。
近年来，表观遗传学的快速进展为植物无痕基因组编辑提供了新策略。与改变DNA序列的RNP递送不同，DNA甲基化、组蛋白修饰和乙酰化等表观遗传修饰不改变DNA序列，使其成为无痕、无转基因成分编辑的可行选择。该技术已成功用于拟南芥dCas9-SunTag系统对多种启动子的靶向编辑，为调控基因表达和增强环境适应性提供了有前景的方法。然而，这种表观遗传修饰的稳定性和可遗传性仍然可变且依赖情境，许多修饰在没有持续靶向的情况下在后续世代中逐渐回复。尽管表观遗传修饰有潜力成为植物基因组编辑的重要工具，该系统仍需进一步完善，因为dCas9-SunTag系统引起的表观遗传修饰足迹及其脱靶效应构成主要挑战。
未来进展可能源于几个组成部分的持续发展和整合：数据驱动设计（包括人工智能[AI]辅助）、创新递送工具（包括可生物降解纳米载体）以及植物再生的改进（包括减少组织培养依赖的方法）。同时，工程约束如纳米材料的细胞毒性、合成高成本和可控释放困难是主要考虑因素。在数据驱动设计框架内，AI应帮助研究人员以可预测方式优化从编辑组分到实验参数到筛选流程的管线。深度学习模型已能支持更系统的潜在脱靶风险预测和碱基编辑效率预测，从而减少sgRNA选择和编辑窗口设置中的试错。对于先导编辑，学习pegRNA、PBS和RTT设计规则的预测模型已在减少我们对不精确经验方法的依赖。同时，蛋白质语言模型已被用于指导关键先导编辑组分的理性优化，提示改进保真度和扩展编辑窗口的潜力。
超越DNA序列编辑方法，基于表观遗传调控的序列独立策略日益被认可为无转基因成分编辑的补充方向。植物中DNA甲基化模式编辑工具正变得更加系统和可控。例如，研究人员已在拟南芥中建立了可组合、可调的DNA甲基化编辑平台，通过效应蛋白和靶向模块的协同设计实现对确定基因组位点甲基化状态的精确控制。这些研究强调将表观基因组编辑发展为可重复、可推广的框架，而非仅关注个体表型结果，使其更接近纳入育种流程。然而，表观遗传编辑仍须采用与基于序列编辑相同的标准进行评估，包括位点特异性、编辑效果的稳定性和可逆性、以及跨世代遗传，然后才能被视为可扩展的无转基因成分解决方案。
展望未来，"设计-递送-再生/筛选"数据流可与多组学、表型组学和基因组选择平台整合，使无转基因成分编辑更易于使用常规育种流程执行，从而降低验证成本，同时提高可遗传产出稳定性，将可编程编辑转化为可量化过程。这些步骤可能导致向模型驱动的设计-构建-测试-学习循环的增量收敛，其中精准编辑标准化而非取代经典育种。使这些循环成为现实需要各种组分：高回收率、分子清洁性、稳定遗传以及对作物间变异性的现实处理。
最后，为资源有限环境设计低门槛无转基因成分工作流程将很重要。廉价、具成本效益、快速的植物胁迫生理研究方法使高质量研究能在低收入国家和资源有限的实验室进行；同样原则可适用于无转基因成分基因组编辑。优先考虑需要较少专业设备、降低每样本分子负担并提供可扩展读数（如简化基因分型和高通量分子检测）的递送和筛选选项，可帮助防止无转基因成分编辑被限制于高资源地区而不放松分子验证标准。这种可及性可拓宽数据可用性、扩展作物和性状覆盖范围，并加速与当地相关的性状改良。
