一种用于根组织中铝（Al）和铅（Pb）组织定位（histolocalization）的新方法，以生长在铁矿尾矿中的长苞香蒲（Typha domingensis Pers.）为材料进行测试

《Protoplasma》：A novel method for the histolocalization of Al and Pb in root tissues, tested in Typha domingensis Pers. grown in iron mining tailings

　　

本研究旨在测试一种利用铬天青S（Chrome Azurol S, CAS）和邻苯三酚红（Pyrogallol Red, PGR）分别进行铝（Al）和铅（Pb）组织定位（histolocalization）的新方法，使用生长在含铁矿尾矿中的长苞香蒲（Typha domingensis Pers.）的根部作为材料。对于CAS和PGR，研究人员测试了两种溶剂（pH 6.7蒸馏水和100 mM磷酸盐缓冲液pH 5.0）、两种浓度（0.1%和0.5%, m V?1）以及三种反应时间（1、5和10 min）。研究人员在长苞香蒲（T. domingensis）植物中测试了CAS和PGR对Al和Pb的组织定位，这些植物在淹水的铁矿尾矿中生长了180天，尾矿含有2385.6 mg Al Kg?1和6.8 mg Pb Kg?1；作为对照，研究人员使用了来自未污染地点的自然种群的植物。生长在铁矿尾矿中的长苞香蒲（T. domingensis）根部积累了1384 mg Kg?1的Al和18 mg Pb Kg?1。CAS和PGR在未污染根部的组织中未产生反应；然而，在所有测试条件下，CAS和PGR均与污染根部的组织发生了反应。CAS染色证实了污染根部表皮和皮层根细胞的细胞质囊泡中存在紫色和红色的Al。在污染根部应用PGR突出了表皮和皮层中淡粉色和红色囊泡内细胞质Pb的存在。CAS和PGR均在维管柱的细胞壁上产生了微红色调，表明存在Al和Pb。因此，CAS和PGR可用于污染根组织中Al和Pb的组织定位。

论文解读：铝和铅在植物根组织中的新型组织化学定位方法研究

研究背景与意义：

全球多地面临铁矿尾矿坝溃决带来的环境灾难，如巴西2015年的Fund?o尾ings dam failure，释放约5000万m3尾矿，造成大面积环境污染。这些尾矿通常含有高浓度且具有植物毒性的铝（Al）和铅（Pb）。长苞香蒲（Typha domingensis Pers.）是一种耐受多种重金属（如Cd、Cr、Pb、Al）的水生植物，常用于修复系统和受干扰湿地植被恢复，且多将污染物分配在根部。然而，关于该物种在铁矿尾矿中生长的耐受性及其Al和Pb的亚细胞分配机制尚不清楚。目前可用的Al和Pb组织定位（histolocalization）方法（如苏木精染色、磺基水杨酸铑酸钠、荧光染色等）存在灵敏度低、特异性差、成本高或需昂贵设备（如荧光显微镜）等局限。因此，开发高灵敏度、低成本的新方法具有重要意义。本研究假设铬天青S（CAS，常用于Al分光光度测定）和邻苯三酚红（PGR，常用于Pb分光光度测定）可用于植物组织中Al和Pb的组织定位，并以生长在铁矿尾矿中的长苞香蒲（T. domingensis）根为材料进行验证。该论文发表在细胞生物学与植物科学领域期刊《Protoplasma》。

主要关键技术方法：

研究人员以未污染地点自然生长的长苞香蒲（T. domingensis）为对照，以在含铁矿尾矿（含2385.6 mg Al Kg^?1和6.8 mg Pb Kg^?1）中水培180天的克隆植株为污染样本。通过原子吸收分光光度计定量根部Al（1384 mg Kg^?1）和Pb（18 mg Kg^?1）含量。根组织经70%乙醇固定、切片、10%次氯酸钠（NaClO）澄清后，分别用不同条件（溶剂：蒸馏水pH 6.7或100 mM磷酸盐缓冲液pH 5.0；浓度：0.1%或0.5%；反应时间：1、5或10 min）的CAS和PGR溶液染色，蒸馏水洗去多余染液后制成显微装片，使用光学显微镜观察并记录结果。

研究结果：

Histolocalization of Al（铝的组织定位）：

未污染根组织无论是否用CAS染色均无任何染色迹象。生长在铁矿尾矿中的污染根组织，经CAS染色后，在表皮和皮层细胞的细胞质中显示出明显的紫色或红色球形囊泡（ vesicles），表明Al的存在；维管柱（木质部和韧皮部）的细胞壁则呈现微红色调，也指示Al的存在。无论是使用蒸馏水还是磷酸盐缓冲液（pH 5.0）作为溶剂，无论是0.1%还是0.5%的CAS浓度，也无论是1、5还是10分钟的反应时间，均能观察到上述染色效果，条件和浓度/时间的变化未影响定位结果。

Histolocalization of Pb（铅的组织定位）：

未污染根组织经PGR染色后与未染色组织无异，无囊泡或细胞壁染色。污染根组织经PGR染色后，在表皮和皮层细胞中显示出淡粉色或红色的细胞质囊泡，维管柱细胞壁上也呈现微红色调，表明Pb的存在。同样，使用蒸馏水或磷酸盐缓冲液、0.1%或0.5%浓度、1至10分钟反应时间，均能稳定重现上述Pb定位结果。

讨论部分总结：

Al组织定位使用CAS：CAS染色显示的红色和紫色囊泡及细胞壁微红色调与CAS-Al复合物在溶液中的显色特征相符（紫色复合物较早形成，红色复合物随时间较长出现）。这支持了CAS可有效定位植物组织中Al。结果显示Al主要聚集在表皮和皮层细胞的胞质囊泡中（符合许多植物物种Al集中在液泡/囊泡的已知机制），少部分可能在细胞壁（呈较弱微红色调，可能因Al含量较低或与细胞壁成分结合导致反应性弱）。这是首次揭示长苞香蒲（T. domingensis）根中Al的亚细胞分布。

Pb组织定位使用PGR：PGR染色显示的淡粉色/红色胞质囊泡及维管柱细胞壁微红色调与Pb-PGR复合物的溶液显色一致。未污染根无此染色，证实PGR可特异性检测植物组织中的Pb。结果表明Pb在该物种根中主要积累于表皮和皮层细胞的胞质囊泡中，少部分可能与维管柱细胞壁结合。这与Pb常被根皮层屏障滞留及在一些植物中见于胞质囊泡的报道一致，也是首次明确该物种根中Pb的亚细胞分配。

测试的Al和Pb组织定位参数：研究表明CAS和PGR均是可行的组织化学染色剂。最低测试浓度（0.1%，接近其分光光度测定常用浓度）、最短时间（1 min）及两种溶剂（蒸馏水pH 6.7和磷酸盐缓冲液pH 5.0）均能有效显色，操作简便，条件宽容度高，利于推广应用。

结论（翻译）：

铬天青S（CAS）能够进行植物组织中铝（Al）的组织定位，可使用0.1% (m V^?1) 或更高浓度，溶于蒸馏水或100 mM磷酸盐缓冲液pH 5.0，反应时间至少1分钟。CAS与Al的反应形成红色或紫色的Al-CAS复合物，在细胞质囊泡中明显可见，并使含有Al的细胞壁产生微红色调。

邻苯三酚红（PGR）能够进行植物组织中铅（Pb）的组织定位，可使用0.1% (m V^?1) 或更高浓度，溶于蒸馏水或100 mM磷酸盐缓冲液pH 5.0，反应时间至少1分钟。PGR与Pb的反应形成淡粉色或红色的Pb-PGR复合物，在细胞质囊泡中明显可见，并使含有Pb的细胞壁产生微红色调。

生长在淹水铁矿尾矿中的长苞香蒲（Typha domingensis）植物根部似乎主要将Al和Pb积累在表皮和皮层细胞的细胞质囊泡中。

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