《Allergy》：Mapping Allergen B- and T-Cell Epitopes: Technological Advances and Their Role in Precision Allergy Therapy
过敏性疾病源于对环境中有害蛋白质的异常免疫识别，其驱动力为过敏原与适应性免疫系统之间表位特异性的相互作用。尽管组分解析诊断已改善了对致敏状态的分子表征，但其仍局限于全过敏原分辨率，无法捕捉最终决定临床反应性、交叉反应性及治疗结局的免疫识别的精细特异性与异质性。越来越多的证据表明，过敏性致敏、严重程度及耐受性均由离散的B细胞和T细胞表位而非完整的过敏原分子所调控。本综述全面概述了在分子分辨率水平进行过敏原表位图谱绘制的已建立及新兴技术。对于B细胞表位，研究人员讨论了基于肽段的筛选方法、展示技术、深度突变扫描、结构及生物物理方法，以及计算预测方面的进展。对于T细胞表位，研究人员总结了鉴定过敏原衍生的、由HLA分子提呈并被T细胞受体识别的肽段的实验与计算策略，强调了HLA多样性对个体化免疫反应的影响。最后，研究人员探讨了表位解析的过敏原谱分析对下一代诊断、功能性细胞检测、改进的风险分层、交叉反应预测以及更安全、更精准的免疫治疗合理设计的临床与转化意义。这些方法的综合应用支持了过敏性疾病精准医学策略的发展。
**引言**
过敏性疾病源于对环境中有害蛋白质的异常免疫识别。虽然过敏的临床症状通常易于识别（范围从轻度瘙痒和红肿到危及生命的过敏反应），但研究人员对这些反应背后免疫机制的分子层面的认识仍不全面。过敏性疾病的中心环节是过敏原与适应性免疫系统之间的相互作用，特别是过敏原特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞，它们识别过敏原蛋白上的离散区域，即表位。在过敏性致敏过程中，环境蛋白在皮肤、呼吸道或胃肠道黏膜等上皮屏障组织接触免疫系统。这些蛋白被抗原提呈细胞捕获，特别是树突状细胞，后者加工过敏原并将肽段表位提呈于主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）II类分子上，供初始CD4
+ T细胞识别。在具有特应性体质的个体中，这种相互作用促进T辅助2型（T
H2）细胞的分化，进而驱动B细胞活化以及向免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）E的类别转换重组。所产生的IgE抗体识别完整过敏原上的构象表位，并与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，从而使这些效应细胞在过敏原再次暴露时能够快速活化。因此，免疫识别通过两种互补机制运作：T细胞识别由抗原提呈细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）提呈的加工后肽段表位，而B细胞则识别过敏原的三维特征。这种分工奠定了致敏和效应反应的基础，并为理解过敏性疾病的变异性提供了框架。
传统上，粗提物或纯化过敏原被用于诊断和免疫治疗。然而，由于过敏原组成和浓度存在固有异质性，这些制剂在确定致敏模式或预测临床结局方面的分辨率有限。随着组分解析诊断（Component-Resolved Diagnosis, CRD）的出现，得以区分同一来源内对单个过敏原的致敏，为诊断提供了分子分辨率并指导精准治疗。然而，仅依靠过敏原特异性IgE水平无法良好预测临床严重程度，因为IgE水平较低的患者可能经历严重反应，而IgE水平较高的患者却可能无症状，使得直接激发试验成为明确的诊断标准。
越来越多的证据表明，免疫识别通常并非由整个过敏原而是由特异性表位所调控，这些表位与IgE或T细胞受体（T-Cell Receptors, TCRs）相互作用。例如，两位对主要花生过敏原Ara h 2致敏的个体可能识别该过敏原上不同的表位模式，导致不同的临床反应性和同样不同的严重反应风险。类似地，T细胞反应可能针对不同的过敏原衍生肽段，影响免疫反应是倾向于T
H2介导的炎症还是调节性耐受。因此，在表位水平绘制免疫识别图谱，为塑造过敏性致敏、临床反应性和治疗结局的分子机制提供了关键洞见。
本综述中，研究人员总结了用于鉴定和表征过敏原B细胞和T细胞表位的已建立和新兴技术，包括基于肽段的筛选、展示技术、结构和生物物理方法、高通量图谱平台以及计算预测工具。研究人员进一步讨论了临床视角，以及引入表位水平诊断如何推进诊断、改善风险分层，并指导下一代免疫治疗的合理设计。
**2 B细胞表位图谱绘制技术**
**2.1 B细胞表位：结构识别**
在过敏性疾病中，过敏原的免疫识别通过两种互补机制发生：T细胞在抗原加工后识别肽段，以及抗体对过敏原三维表位的结构识别。B细胞表位图谱绘制聚焦于后者，即鉴定过敏原表面决定效应细胞活化的IgE结合区域。多价过敏原交联肥大细胞或嗜碱性粒细胞上FcεRI结合的IgE，触发脱颗粒并释放导致过敏症状的炎症介质。因此，定义这些抗体-过敏原相互作用的分子结构对于理解IgE介导的过敏反应至关重要。
B细胞表位可广义分为线性表位（由连续氨基酸序列组成）和构象表位（由蛋白折叠后靠近的非连续残基形成）。过敏原-抗体复合物的结构研究表明，大多数IgE表位为构象表位，这凸显了维持天然过敏原结构对于准确表位表征的重要性。因此，仅依赖短线性肽段的方法往往只能捕获抗体-抗原界面的一部分，并可能忽略过敏原识别的关键结构决定因素。
**2.2 鉴定过敏原特异性B细胞表位的挑战**
IgE表位的实验图谱绘制进一步受到血清中过敏原特异性IgE通常含量较低以及患者反应具有高度多克隆性质的困扰。此外，对同一过敏原致敏的个体经常识别不同的表位库，这受到遗传背景和免疫史的影响。这种异质性对交叉反应性、临床风险和治疗策略具有重要影响。因此，精确定义B细胞表位对于理解过敏性致敏和交叉反应性的分子基础，以及指导改进的诊断、合理的免疫治疗设计和IgE阻断治疗剂至关重要。过去二十年间，已经涌现出多种方法工具箱来应对这些挑战，包括基于肽段的筛选、展示技术、突变扫描、结构和生物物理方法以及计算预测工具。
**2.3 B细胞表位图谱绘制方法**
**2.3.1 基于肽段的表位图谱绘制**
基于肽段的技术被广泛用于表征过敏原中的IgE结合区域。经典肽段扫描采用重叠合成肽段（通常10-15个氨基酸长）来映射过敏原序列上的线性表位。高通量改进方案包括SPOT（膜支持合成肽段阵列），其中肽段直接在纤维素膜上生成以进行平行筛选；以及高密度肽段微阵列（High-Density Peptide Microarrays, HDPM），可在玻璃片上原位合成数千至数百万个肽段，实现精细分辨率的平铺和替换文库，且血清需求量极少。
反映其可及性和可扩展性，免疫表位数据库（Immune Epitope Database, IEDB）中收录的大多数过敏原B细胞表位均通过基于肽段的检测方法鉴定，其中线性表位远多于构象表位（6013 vs. 221）。肽段图谱绘制已成功应用于多种主要过敏原，包括花生过敏原Ara h 2和Ara h 3，以及桃子过敏原Pru p 3。然而，由于这些方法依赖短肽段，无法完全捕捉依赖天然蛋白折叠的构象表位。因此，通常需要能够保留折叠抗原结构或以更高分辨率解析抗体-抗原复合物的互补方法。
**2.3.2 基于展示的筛选和突变文库**
作为基于肽段合成方法的替代方案，基于展示的技术能够在生物宿主表面呈现过敏原衍生的肽段或蛋白以进行抗体筛选。最广泛使用的平台是噬菌体展示或酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD），它们通过表达过敏原片段于表面将基因型与表型联系起来，随后可筛选抗体结合。这些平台能够生成大量过敏原肽段或片段文库（10
5, 10
6）用于IgE识别筛选。
在噬菌体展示中，肽段或蛋白片段与噬菌体外壳蛋白融合并在
大肠杆菌中表达，通过迭代淘选周期实现抗体结合克隆的高通量筛选。这种方法特别适合鉴定线性表位和模拟表位（mimotopes）——模拟构象表位的肽段——已在梯牧草花粉过敏原Phl p 5和屋尘螨过敏原Der p 1等过敏原中得到证实。然而，细菌表达系统缺乏正确二硫键形成所需的翻译后加工机制和氧化折叠环境，限制了其对复杂构象表位的应用，如非特异性脂质转移蛋白（non-specific Lipid Transfer Proteins, nsLTPs）中的表位。相比之下，YSD（通常使用
酿酒酵母）允许呈现具有真核折叠能力的较大片段或全长过敏原，包括二硫键形成和可能的糖基化。这增加了保留天然样构象的可能性，并促进构象表位的图谱绘制，已在蜂毒过敏原Ves v 1、2和5中得到证实。IgE结合可 subsequently 通过流式细胞术定量，实现高通量筛选。
基于展示的系统还支持深度突变扫描（Deep Mutational Scanning, DMS），这是一种新兴方法，系统评估单个氨基酸对抗体识别的贡献。包含大量单氨基酸变体的文库可筛选抗体结合，下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）能够实现关键表位残基的定量图谱绘制。Chen等人利用噬菌体展示结合NGS，鉴定了包括Ara h 1、2、3和7在内的几种花生过敏原中的共享IgE表位，突出了有助于相关蛋白间交叉反应性的残基。揭示哪些单个残基支撑相关蛋白家族间的交叉反应性，可能为合理设计低致变应原变体或免疫治疗用共识过敏原提供信息。
虽然基于展示的筛选可以鉴定候选表位区域和关键残基，但可能受到患者血清中过敏原特异性IgE浓度较低以及展示过程中正确蛋白折叠难以维持的限制。因此，结构方法可能是完全定义抗体-过敏原界面所必需的。
**2.3.3 表位的结构和生物物理表征**
结构和生物物理技术为过敏原-抗体相互作用提供详细见解，包括结合界面、构象表位以及IgE介导效应细胞活化所需的空间排布。这些技术的巨大进步，连同高通量图谱平台，已经实现了对IgE和IgG表位景观日益详细的表征。
X射线晶体学仍然是解析过敏原-抗体复合物原子分辨率结构的关键方法，揭示了过敏原识别背后的分子结构。迄今为止，蛋白质数据库中绝大多数过敏原-抗体复合物结构由X射线晶体学确定，反映了其在定义表位-互补位界面方面对过敏研究的核心作用。然而，由于IgE固有的柔性、大分子量（~190 kDa）和潜在的糖基化模式，解析与抗原结合的全长IgE结构具有挑战性。因此，重组IgG衍生的Fab片段或scFv被常规用于促进结构研究。过敏原与鼠源或人源抗体衍生的Fab结构域结合的晶体结构已导致Bet v 1（桦树花粉）、Bla g 2（德国蟑螂）、Der p 1和Der p 2（屋尘螨）、Gal d 4（鸡）以及Ara h 2和Ara h 6（花生）等多种过敏原上多个表位的图谱绘制。
与X射线晶体学相比，冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, cryo-EM）是一种高度通用的技术，用于解析其天然生理相关状态下大型、异质且更柔性复合物的高分辨率结构。这使得全长IgE与其主要受体FcεRI结合的结构得以解析，为效应细胞上IgE交联所需的受体结合过程提供了机制性见解。Cryo-EM还被用于解析Bet v 1与3种治疗性单克隆抗体候选物REGN5713、REGN5714和REGN5715复合物的结构。此外，cryo-EM的最新方法学进展正在不断降低以往的大小限制，使得更小更柔性的复合物（< 50 kDa）的结构表征成为可能，同时所需的蛋白量远低于晶体学，为研究抗体-过敏原相互作用开辟了新机遇。虽然cryo-EM仍被认为是过敏原表位图谱绘制的新途径，但冷冻电子显微镜-based多克隆表位图谱绘制（cryo-EMPEM）等新兴结构血清学方法通过实现血清抗体对靶抗原的直接结构评估，已经改变了该领域。虽然目前主要应用于病毒抗原如流感血凝素（HA）、SARS-CoV-2刺突蛋白和HIV Env，这些方法可能代表分子过敏学中有前景的工具组。
与捕获静态状态的晶体学和cryo-EM不同，核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）波谱提供了一种基于溶液的表位图谱绘制方法。NMR表位图谱绘制依赖于检测过敏原在抗体结合时的化学位移扰动或信号强度变化，从而揭示结合界面处或附近的残基。这对于较小的过敏原（通常< 20-25 kDa）特别有用，尤其是在结晶困难或结合预期涉及柔性或多个构象状态时。然而，灵敏度和大小限制通常将NMR研究局限于过敏原结合的Fab片段，使其作为与cryo-EM、氢氘交换质谱（Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS）或建模相结合的方法最为有效。
HDX-MS是另一种基于结合时溶剂可及性降低来表征表位区域的方法。该方案鉴定溶液中的构象足迹，对于柔性和难以结晶的复合物具有高度价值。HDX-MS可进一步由交联质谱支持，后者突出复合物形成过程中的溶剂暴露或接触保护区域。
**2.3.4 计算表位预测和建模**
尽管实验表位图谱绘制取得了重大进展，但抗体-过敏原相互作用的全面表征在技术上仍然具有挑战性且资源密集。因此，计算方案在指导实验研究、优先排序候选表位和解释结构相互作用数据方面发挥着越来越重要的作用。表位预测方法大致分为两类：基于序列的预测器，直接从氨基酸序列推断表位可能性；以及基于结构的预测器，分析三维抗原结构以识别可能与抗体相互作用的表面区域。
早期基于序列的方法依赖于简单的氨基酸性质标度（如亲水性或表面溶剂可及性），但仅略优于随机预测，实际应用有限。现代方法转而采用机器学习和蛋白质语言模型，在大型序列数据集上训练以识别与抗体识别相关的序列模式。例如，BepiPred-3.0整合了ESM-2蛋白质语言模型，这是一种在数百万蛋白质序列上训练的深度神经网络，学习残基之间的上下文关系，可以直接从序列推断结构特征。与早期基于序列的方法相比，这些模型改进了线性和构象表位的预测。
基于结构的预测器通常实现更高的准确性，因为大多数抗体表位是构象表位，依赖于抗原表面的三维组织。早期工具如DiscoTope-2.0使用结构统计和空间建模来识别可能的抗体结合区域。蛋白质结构预测的最新突破，特别是AlphaFold等深度学习框架，极大地扩展了可靠抗原结构的可用性，使得基于结构的表位预测得以更广泛的应用。DiscoTope-3.0等较新工具通过整合结构特征与ESM-IF1逆折叠模型所学习到的表示进一步改进性能，后者捕捉蛋白质结构与兼容氨基酸序列之间的关系。
除了表位预测，计算建模越来越多地用于探索原子分辨率的过敏原-抗体相互作用。结构预测结合分子动力学模拟和相互作用能分析可以识别关键接触残基、定义表位热点，并指导靶向诱变或低致变应原设计。这些方案在过敏原-抗体复合物的实验结构不可用时特别有价值。另一类相关但概念不同的方法试图预测或排序完整的抗体-抗原界面，而非仅预测表位区域。Chai-2或AbEpiToPe等工具评估特定抗体和抗原结构之间的兼容性以估计结合可能性。与独立于特定抗体而识别潜在抗体结合区域的表位预测器不同，这些模型试图对完整的蛋白质-蛋白质相互作用界面进行评分。虽然前景可期，这些方法尚未系统应用于IgE-过敏原相互作用或过敏原家族间交叉反应性的建模。
尽管近期取得了实质性进展，几个关键挑战仍然阻碍更准确的B细胞表位预测工具的开发。一个主要限制是实验解析的抗原-抗体复合物结构稀缺，这限制了基于序列和基于结构的方法。此外，当前工具通常预测抗原上可能可抗体接触的区域，但无法可靠地确定特定抗体序列将识别哪个表位。预测性能的基准测试因抗原-抗体相互作用空间的不完整采样而复杂化：许多预测的表位位点可能仅因结构数据集仅捕获所有可能抗体结合事件的一小部分而表现为假阳性。
同时，致敏性预测工具已被开发用于基于与已知过敏原的序列或结构相似性来识别具有致敏潜力的蛋白质。与表位预测方法不同，这些工具旨在识别能够引发过敏反应的蛋白质，而非识别特定的抗体或T细胞结合区域。一些预测器如NetAllergen结合了序列和结构过敏原特征以及常见过敏患者MHC II类等位肽结合的预测，以估计致敏潜力。
**3 T细胞表位图谱绘制技术**
**3.1 T细胞表位：生成与提呈**
虽然B细胞表位图谱绘制关注完整过敏原的结构区域，T细胞表位图谱绘制则涉及免疫识别的互补方面。T细胞表位不存在于天然过敏原表面，而是源于细胞内抗原加工，其中过敏原被酶解为肽段，提呈于MHC II类分子（称为人类白细胞抗原，Human Leukocyte Antigens, HLA）上供TCR识别。鉴定T细胞表位的技术因此需要能够考虑抗原加工、肽段-MHC结合和功能性T细胞检测的方法。
实际上，过敏原特异性T细胞表位的发现通常遵循整合计算预测和实验验证的分步工作流程。首先使用HLA结合算法或生成涵盖过敏原序列的重叠肽段文库来预测候选肽段。这些肽段被合成并检测其在来自过敏个体的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）检测中激活过敏原特异性T细胞的能力，通常通过增殖或细胞因子产生来评估。能够激发T细胞反应的肽段subsequently 可使用肽段-MHC（pMHC）多聚体染色进行验证，实现表位特异性T细胞的直接鉴定。最后，单细胞测序方法允许对抗原特异性TCR库和功能表型进行更深入表征。
**3.2 抗原加工和肽段提呈**
在过敏性致敏中，过敏原衍生肽段主要通过MHC II类途径提呈，使CD4
+ T细胞能够识别。抗原提呈细胞，特别是树突状细胞，内化外源性过敏原并在内体和溶酶体区室中加工，产生长度不等的肽段片段。新合成的MHC II类分子在内质网中与不变链（Ii）组装，Ii稳定复合物并通过占据肽段结合槽防止过早的肽段结合。Ii-MHC II类复合物经高尔基体运输至专门的抗原加工区室，其中不变链被逐步降解，留下II类相关不变链肽段（CLIP）结合于肽段结合槽中。HLA-DM随后催化CLIP与高亲和力过敏原加工产生肽段的交换。所得的pMHC II类复合物被运输至细胞表面供CD4
+ T细胞识别。在2型偏斜的微环境中，这些相互作用促进初始CD4
+ T细胞分化为T
H2细胞。
**3.3 HLA多态性与表位多样性**
提呈给T细胞的过敏原衍生肽段库受到HLA分子遗传变异的强烈影响。人MHC II类分子（HLA-DR、-DQ和-DP）表现出显著的遗传多态性，意味着不同个体可能提呈不同的过敏原衍生肽段。在过敏背景下，这种变异性影响个体的T细胞反应，进而影响过敏性疾病的易感性或耐受性。例如，HLA-DR和-DP等位基因与屋尘螨过敏原Der p 1和Der p 2的免疫反应相关，而HLA-DQ变体与花生及其他食物过敏相关。大规模队列研究，包括卡塔尔生物库和法国EGEA项目，已识别出致敏和哮喘的保护性和风险性等位基因。互补的HLA转基因小鼠模型进一步定义了等位基因特异性表位限制，强调了HLA多样性在过敏发病机制中的核心作用及其对精准免疫治疗的潜在应用价值。
**3.4 肽段-MHC复合物的T细胞识别**
pMHC复合物的TCR识别决定了T细胞活化和特异性。在过敏个体中，提呈过敏原肽段的2型常规树突状细胞（cDC2）促进初始CD4
+ T细胞分化为T
H2细胞。这种极化由IL-4等细胞因子或上皮来源的警报素（包括TSLP和IL-33）驱动，这些因子调节抗原提呈细胞以支持T
H2表型。活化的过敏原特异性T
H2细胞通过产生IL-4和IL-13 orchestrate 过敏性级联反应，后者驱动B细胞类别转换至IgE；以及IL-5，其促进嗜酸性粒细胞募集、成熟和活化。然而，过敏中的T细胞反应是异质的，还可能涉及调节性T细胞（Treg）、TH1和TH17亚群，它们对疾病调节和临床异质性有贡献。T细胞交叉反应性可进一步影响过敏反应，因为过敏原特异性T细胞可能识别相关过敏原之间的同源肽段表位。此类交叉反应性表位可能维持过敏原特异性记忆T细胞反应，即使在原始致敏过敏原不存在的情况下也能维持IgE产生。
**3.5 鉴定过敏原特异性T细胞表位的挑战**
过敏原特异性T细胞表位的实验图谱绘制存在若干挑战。T细胞反应受到HLA多态性的强烈影响，导致肽段识别和TCR-HLA限制的个体间变异性较大。此外，抗原加工和肽段提呈不能直接从蛋白质序列预测，观察到的反应往往反映了肽段结合、抗原加工效率和TCR库多样性之间的复杂相互作用。而且，过敏原特异性T细胞在外周血中通常频率较低，使其检测具有技术性挑战。
因此，精确的T细胞表位图谱绘制对于理解过敏性致敏、免疫调节和耐受的细胞机制至关重要。T细胞表位图谱绘制可以指导基于肽段的免疫治疗设计、改善HLA相关疾病易感性的理解，并为相关过敏原之间交叉反应机制提供洞见。
**3.6 T细胞表位图谱绘制方法**
**3.6.1 T细胞表位的计算预测**
计算预测通常用于T细胞表位发现的第一步，允许优先排序可能结合特定HLA II类分子的肽段。大多数过敏研究依赖于泛等位基因预测算法，如NetMHCIIpan，以及托管在社区服务器上的共识预测器。这些工具基于大型训练数据集估计pMHC结合，广泛应用于过敏研究中的CD4+表位图谱绘制。
最新迭代越来越多地整合质谱衍生的免疫肽组数据和多等位基因反卷积，改善了既往代表性不足的HLA II类分子的基序学习和提呈预测。这使得能够快速筛选跨越大型HLA等位基因面板的整个过敏原序列，并在设计过敏原免疫治疗时支持群体水平的覆盖分析。
然而，预测性能仍然多变。使用精选过敏原数据集的基准分析经常报告非表位的过预测，以及预测HLA结合与实验验证T细胞反应之间仅适度的一致性。另一个限制是对抗原加工和翻译后修饰的建模有限。当前预测器作用于经典肽段序列，不考虑N-糖基化、瓜氨酸化或氨基酸氧化等翻译后修饰，尽管有证据表明这些修饰可以影响蛋白酶切割、HLA结合和提呈肽段库。由于许多过敏原在体内或食物加工过程中发生糖基化或其他修饰，计算预测可能错误估计表位密度或特异性。因此，计算预测通常用于优先排序候选肽段以进行实验验证，而非替代功能性检测。
**3.6.2 使用肽段文库和PBMC检测的实验筛选**
过敏原特异性T细胞表位的实验图谱绘制通常依赖于筛选肽段文库激活来自过敏个体T细胞的能力。来自患者的PBMC与涵盖过敏原序列的重叠肽段文库共培养，基于T细胞活化鉴定候选表位。
肽段文库通常由重叠的15-20聚体肽段组成，适应MHC II类分子可变结合长度的特征。T细胞活化可通过多种功能性读数测量，包括增殖检测、ELISA细胞因子检测、ELISpot或流式细胞术联合细胞内细胞因子染色。
该策略已被广泛应用于鉴定过敏原中的免疫优势CD4+ T细胞表位。例如，肽段文库筛选已用于表征梯牧草花粉过敏原Phl p 1和花生过敏原Ara h 2中的T细胞表位。在这些研究中，来自过敏个体的PBMC被过敏原衍生肽段刺激，以评估抗原特异性T细胞克隆的增殖并定量细胞因子产生细胞。
肽段筛选可以以HLA结合非依赖方式使用完整的重叠肽段文库进行，或者候选肽段可在实验测试前使用netMHCIIpan等计算预测工具进行优先排序。重要的是，这些检测测量的是功能性T细胞活化而非直接的pMHC结合，从而能够绘制驱动过敏反应的免疫原性表位。
**3.6.3 pMHC四聚体和单细胞TCR测序**
肽段-MHC II类四聚体被广泛用于直接鉴定和定量抗原特异性T细胞。这些试剂由多聚体pMHC复合物与荧光团偶联组成，使流式细胞术检测表位特异性T细胞成为可能。
由于TCR通常以相对较低的亲和力结合pMHC II类复合物，已开发出高阶多聚体形式以提高检测灵敏度。近期方法使用DNA条形码化的pMHC多聚体，其中每种pMHC特异性与连接于葡聚糖支架的独特DNA序列相连。这使得能够在单个样本中多重筛选多种pMHC特异性。过敏原特异性T细胞可通过荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）富集，DNA条形码测序可以鉴定相应的pMHC特异性。该方法可与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合，以高通量同时确定TCR/pMHC配对。
基于四聚体的方法已被用于鉴定过敏原特异性T细胞反应，并确定黑麦草花粉过敏原Lol p 1、猫皮屑过敏原Fel d 1和艾草花粉过敏原Art v 1等过敏原的优势表位。然而，稳定pMHC II类试剂的生成仍然存在技术性挑战，且识别pMHC II类复合物的TCR交叉反应性可能使结合数据的解释复杂化。
**3.6.4 活化诱导标志物检测和细胞因子分析**
活化诱导标志物（Activation-Induced Marker, AIM）检测为鉴定过敏原特异性T细胞提供了一种不依赖预定义pMHC复合物的替代策略。抗原识别时，活化的T细胞上调特征性表面标志物，如CD4+ T细胞上的CD154（CD40L）和CD137，或CD8+ T细胞上的CD69和CD137。由于检测基于活化标志物而非细胞因子分泌，AIM检测能够灵敏鉴定和分选稀有抗原特异性T细胞。
AIM检测可与细胞因子分析结合以表征功能性T细胞表型。细胞因子反应可通过细胞内染色、ELISpot或通过ELISA或多重分析培养上清液来测量。这些方案能够鉴定不同的功能性亚群，包括TH1、TH2、TH17或调节性表型。
高维免疫图谱绘制的最新进展进一步扩展了这些分析的分辨率。质谱流式细胞术（Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF）或scRNA-seq等技术允许在单细胞分辨率详细表征过敏原特异性免疫反应。例如，CyTOF已被用于鉴定与婴儿IgE介导花生耐受相关的免疫细胞特征，而scRNA-seq已揭示屋尘螨致敏哮喘中改变的免疫基因表达谱。虽然这些方法为过敏原特异性免疫反应提供了深入的表型见解，但目前对于将抗原特异性与个体T细胞克隆型联系起来的分辨率有限。
AIM检测、细胞因子分析和高维免疫图谱绘制共同为鉴定和功能表征过敏原特异性T细胞表位提供了互补工具。T细胞表位图谱绘制的见解正日益指导临床应用，包括改进诊断和靶向过敏原免疫治疗的开发。
**4 临床转化与未来应用**
表位水平的见解正日益指导过敏性疾病的临床管理。通过在分子精度上解析IgE和T细胞反应性，这些数据提高了诊断准确性，细化了风险分层，并指导了靶向免疫治疗或低致变应原植物变体生成的合理设计。虽然大多数表位图谱技术仍属于研究工具，但新兴证据表明，表位解析的过敏原谱分析可能补充现有诊断框架，特别是CRD，并改善对复杂致敏模式和交叉反应性的解释。
**4.1 表位解析诊断**
CRD已经通过实现鉴定IgE致敏于单个过敏原分子而非粗提物，改善了临床过敏诊断。ImmunoCAP ISAC和ALEX2等商业化平台允许对纯化重组过敏原面板的IgE进行多重检测，生成全蛋白水平的半定量致敏谱。然而，这些平台并未揭示每个过敏原中IgE识别的具体区域。
表位解析诊断（称为CRD 2.0）旨在将这一概念扩展，通过绘制IgE抗体靶向的过敏原特定区域。原则上，定义个体的IgE表位库可以揭示与疾病严重程度、临床反应性或治疗反应性相关的模式。例如，对主要花生过敏原Ara h 2的研究表明，识别更广泛IgE表位的患者比表位谱较窄的患者更可能表现持续性花生过敏和更严重的反应。
尽管前景可期，表位解析诊断向常规临床实践的转化仍具挑战性。许多表位图谱绘制方法依赖短肽段或重组片段，可能无法重现过敏原的天然三维结构或保留关键的翻译后修饰。因此，基于肽段的平台可能难以捕捉构象IgE表位。结果，大多数CRD 2.0方法仍处于实验阶段，在个性化IgE表位指纹能够可靠实施于临床诊断之前，还需要进一步的技术进步。
**4.2 基于细胞的诊断**
虽然血清学检测提供过敏原致敏信息，但需要功能性细胞检测来确定过敏原特异性IgE是否能够触发效应细胞活化，从而预测临床反应性。
嗜碱性粒细胞活化检测（Basophil Activation Test, BAT）和肥大细胞活化检测（Mast Cell Activation Test, MAT）测量过敏原暴露后效应细胞的过敏原诱导脱颗粒。脱颗粒通常通过流式细胞术检测活化标志物如CD63和CD203c的上调来检测。虽然两种检测都评估IgE介导的FcεRI受体交联，但它们在实施上有所不同。BAT使用全血新鲜嗜碱性粒细胞，必须在采血后24小时内进行；而MAT使用体外培养的原代或细胞系来源的肥大细胞（如LAD2），用患者血清致敏，使过敏原特异性IgE结合FcεRI并介导过敏原诱导的活化。
与皮肤点刺试验或血清特异性IgE测量相比，这些检测显示出高诊断特异性，越来越多地用于常规检测结果不明确的情况。在食物过敏诊断中，BAT可以帮助确定是否需要进行口服食物激发。在包括花生、坚果、芝麻、小麦和牛奶在内的多种过敏原中报道了高诊断性能。MAT在某些 setting 中显示出相当或改进的性能，当嗜碱性粒细胞反应不明确时可能特别有用。通过直接评估IgE介导的效应细胞活化，这些检测提供补充分子和表位解析诊断的功能信息，可能帮助将表位图谱绘制见解转化为临床可操作的检测策略。
**4.3 风险分层和交叉反应性预测**
除诊断外，表位水平的表征提供了改善风险分层和临床相关交叉反应性预测的机会。多项研究表明，IgE表位识别的广度和模式可能预测疾病进程，包括儿科人群中耐受性发展的可能性。例如，免疫反应局限于少数非构象表位的儿童可能更可能长大后摆脱过敏，而广泛或持续的表位识别谱与持续性临床反应性相关。这些信息可以帮助指导监测与早期免疫治疗启动之间的决策。
表位图谱绘制还可以改善交叉反应性过敏反应的预测，这经常源于同源过敏原之间共享的结构表位。交叉反应性表位已在包括profilins、Bet v 1同源物和某些牛奶蛋白在内的过敏原家族中被描述，其中表位水平的区分可以显著提高诊断准确性并防止不必要的饮食或环境限制。绘制这些共享表位有助于区分真正的原发致敏和继发性交叉反应，从而改善诊断解释并减少不必要的饮食或环境限制。
同时，结构生物信息学和计算建模正越来越多地用于预测过敏原家族间的交叉反应性表位。虽然这些方法仍主要基于研究，但它们说明了表位水平信息如何为具有复杂致敏谱的患者提供更精确的风险评估。
**4.4 表位指导的免疫治疗设计**
表位解析的过敏原谱也为更安全、更有针对性免疫治疗的合理设计提供了框架。一种策略涉及工程化低致变应原变体，其中IgE结合表位被破坏，同时保留诱导免疫耐受所需的T细胞表位。来源于草花粉过敏原的重组B细胞表位疫苗已在临床研究中显示出前景，诱导能够阻断IgE结合的保护性IgG反应，同时减少即刻过敏反应。
另一种方法涉及含有明确T细胞表位的基于肽段的免疫治疗，避免肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE交联。这些肽段旨在通过T细胞无反应性、免疫偏离或调节性T细胞诱导等机制诱导免疫耐受。使用草花粉衍生肽段的临床试验已证明可减少季节性过敏症状，且具有良好的安全性特征。
这些策略共同说明了详细的过敏原表位知识如何支持具有改进安全性和治疗疗效的下一代免疫治疗的开发。
**5 结论**
过去二十年间，分子和结构免疫学的进展极大地提高了研究人员在表位水平上对过敏原识别的理解。用于B细胞表位图谱绘制的高分辨率方法揭示了构象IgE表位的优势以及患者特异性抗体反应的广泛异质性。互补的实验和计算技术——包括肽段阵列、展示技术、结构生物学和机器学习方法——现在使得对过敏原-抗体相互作用的表征日益详细。
T细胞表位图谱绘制的平行进展为过敏性致敏和免疫调节的机制提供了关键见解。实验检测、肽段-HLA多聚体和单细胞技术正开始解析过敏原反应性T细胞的特异性和功能多样性，而计算预测工具支持跨多样HLA背景的候选表位图谱绘制。
最后，表位解析的过敏原谱分析正开始转化为临床应用。改进的分子诊断、功能性细胞检测和表位指导的治疗策略说明了机制见解如何为患者的分层和治疗设计提供信息。随着表位图谱技术与计算建模和高维免疫图谱绘制的持续整合，它们将为推进过敏诊断、预防和治疗中的精准医学方法提供越来越强大的框架。
