多重MALDI-TOF质谱技术用于同时检测13种鹅病毒

《Journal of Virological Methods》：Multiplex MALDI-TOF MS for simultaneous detection of 13 goose viruses

　　

Fangfang Qiao|Yuetong Huang|Mengyao Wang|Shuting Yang|Jiachen Zhang|Jianhua Zheng|Minhua Sun|Jun He|Ming Liao

中国广州中凯农业工程大学动物科学和技术学院，邮编510225

摘要

全球水禽产业面临着由复杂的多微生物感染导致的日益严重的经济损失，然而传统的诊断方法仍然局限于针对单一病原体的检测流程，在混合感染的情况下效果不佳。本文介绍了一种高通量的多重MALDI-TOF质谱平台，该平台通过检测16个保守的基因组特征，能够同时识别13种重要的鹅源病毒，包括GAstV-1/2（ORF1b）、DRV（p10/L1）、AIV（NP）、TMUV（E）、FAdV（hexon）、GPV（VP1）、DPV（UL6）、NDV（L）、GoCV（Rep）、REV（LTR）、MDPV（VP1）、IBDV（VP2）和ALV（env/p27）。该检测方法表现出出色的分析性能，检测限低至2.87至29拷贝/μL，具有绝对特异性和良好的重复性（ intra- and inter-assay系数变异≤3.3%，相当于精度≥96.7%）。使用74个现场样本（包括口咽/泄殖腔拭子、环境拭子和组织样本）进行的临床验证显示，与qPCR结果的一致性达98.3%，尤其在解决传统方法难以区分的复杂共感染情况时表现更为优越。该平台可处理多种临床样本类型，每次运行可处理384个样本，耗时不到10小时，从而克服了单靶标PCR的低通量和下一代测序的大量资源需求。通过一次分析即可全面解析病原体，这项技术为快速流行病调查、常规监测和基于证据的疾病管理提供了实用且可扩展的解决方案。

引言

中国的水禽养殖规模位居全球首位，其鹅产业在规模和产品质量方面也领先世界（Zhu等，2023年）。中国鹅是一种多功能本地品种，擅长自然害虫控制、高产卵量和优质肉质，使其成为现代化多元化农业中的重要经济贡献者（Massaccesi等，2019年；Ni等，2022年）。然而，大多数鹅仍然在静止的池塘中自由放养且翅膀未被剪短；这种环境为病毒提供了有利条件，导致水传播病原体的扩散，降低了繁殖性能，影响了雏鹅的质量——随着养殖规模的扩大，这些成本迅速上升（Pepin等，2023年）。随着生产系统的工业化和技术密度的提高，新兴鹅病毒（如鹅星状病毒GAstV）以及鹅环状病毒（GoCV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、禽流感病毒（AIV）、禽腺病毒（FAdV）、Tembusu病毒（TMUV）和鹅细小病毒（GPV）的爆发频率不断增加，这些病毒现已在中国许多鹅群中流行（Li等，2024年；Nowak等，2022年；Yang等，2023年；Yao等，2022年；Zhu等，2025年）。此外， circulating病毒谱系还扩展到了外来威胁，如传染性法氏囊病病毒（IBDV），以及已存在于鹅群中的常规水禽病原体，包括鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）和麝香鸭细小病毒（MDPV）（Guo等，2023年；Ren等，2025年；Wang等，2007年）。这些病毒感染会导致鹅死亡或生产性能严重下降，对鹅养殖业造成巨大经济损失。

特别需要关注的是像鹅环状病毒（GoCV）、禽白血病病毒（ALV）和网状内皮细胞病毒（REV）这样的免疫抑制性病原体，因为它们会削弱宿主的免疫力（Li等，2025年；Yang等，2025a）。这些病原体通过破坏免疫防御机制，为其他病原体的入侵创造了机会，常常导致严重的多微生物感染。因此，复杂的共感染现象在野外并不罕见；这些复杂的病原体网络不仅导致非典型的临床表现，使鉴别诊断变得复杂，还通过协同作用加剧了病毒传播和死亡率。例如，GAstV感染经常与GPV和TMUV同时发生，使得临床预防和控制变得更加困难（Xu等，2023年）。

近年来，涉及两种或更多鹅病毒的共感染已成为主要临床表现，导致临床症状重叠且模糊不清，严重干扰了鉴别诊断和治疗干预（He等，2022年）。急性期的诊断需要特定的分子生物学工具来区分具有相似症状的感染。尽管已有基于TaqMan探针的实时定量PCR（RT-qPCR）方法用于鹅的病原体检测，但其通量受到荧光团复用的限制（Yu等，2023年）。此外，尽管下一代测序（NGS）具有无偏见的广谱病原体检测能力，但其常规临床应用受到高昂成本、漫长的检测时间和复杂的生物信息学基础设施要求的限制，不适合快速大规模筛查（Yin等，2021年）。在涉及高病毒滴度和复杂共感染情况的急性爆发期间，这种诊断空白尤为关键，此时需要快速全面的病因分析以及时干预。

本文报道了一种多重MALDI-TOF MS检测方法的开发和分析验证，该方法能够高效检测13种重要的鹅源病毒。该平台经过系统优化，适用于多种样本类型，从非侵入性的口咽和泄殖腔拭子（适用于常规筛查和活体监测）到临床受感染鸟类的死后组织，从而实现生前监测和明确病理诊断的结合。这种集成方法在一次分析中提供了全面的病原体谱型分析，为现代集约化水禽生产中多因素疾病爆发的快速诊断和针对性干预策略提供了有力支持。

片段

病毒株

本研究中评估的鹅源病毒包括鹅星状病毒1型（GAstV-1）、鹅星状病毒2型（GAstV-2）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、禽流感病毒（AIV）、Tembusu病毒（TMUV）、禽腺病毒（FAdV）、鹅细小病毒（GPV）、新城疫病毒（NDV）、鹅环状病毒（GoCV）、网状内皮细胞病毒（REV）、鸭瘟病毒（DPV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、麝香鸭细小病毒（MDPV）和禽白血病病毒（ALV）。所有质粒均为

MALDI-TOF MS的特异性

为了评估分析特异性，采用混合标准质粒（3×10¹拷贝/μL）作为阳性对照，无核酸酶的水作为阴性对照。工作流程如图1所示。如图2所示，阳性对照在预期的m/z位置产生了16个独特的单延伸产物（SEP）峰，对应于13种目标病毒（某些病毒采用多种目标以确保检测特异性）。相比之下，

讨论

本研究开发了一种高通量的多重MALDI-TOF MS检测方法，能够同时检测13种鹅源病毒，包括GAstV 1型和2型、TMUV、FAdV、GPV、DPV、ALV、REV、IBDV、DRV、AIV、NDV、GoCV和MDPV。检测限低至2.87至29拷贝/μL，表现出优异的灵敏度、绝对特异性和良好的重复性。

中国的水禽养殖业经历了快速集约化，将大量禽类挤入了高密度环境中

资助

本工作得到了国家重点生猪和家禽育种产业核心任务攻关项目（项目编号ZQQZ-G16）、国家自然科学基金（项目编号32273036）、广东省现代农业科学技术创新联盟建设项目（项目编号2024CXTD20）、广东省关键学科研究能力提升项目（项目编号2024ZDJS001）以及高水平研究院建设专项资金的支持

Mengyao Wang： 数据分析。Shuting Yang： 验证。Fangfang Qiao： 文本撰写——原始草案、方法学设计、数据管理。Yuetong Huang： 验证。Minhua Sun： 资源管理、项目协调、资金争取。Jun He： 文本撰写——审核与编辑、资源管理、项目协调、资金争取。Jiachen Zhang： 验证。Jianhua Zheng： 监督、项目协调。Ming Liao： 资源管理、项目协调、资金争取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢广州瑞来生物检测有限公司提供的技术支持。