液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC–ESI–MS/MS）分析、抗氧化、抗菌及抗糖尿病特性研究：来自体外（In Vitro）与计算机模拟（In Silico）方法的见解——以Fagonia cretica L.为例

《ChemistryOpen》：Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry Profiling, Antioxidant, Antibacterial, and Antidiabetic Properties of Fagonia cretica L.: Insights From In Vitro and In Silico Approaches

　　

本研究对长期用于传统医学但缺乏系统的实验与计算方法进行表征的Fagonia cretica L.的水提物进行了综合评估。通过液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC–ESI–MS/MS）建立的植物化学轮廓显示，其主要成分为酚酸类（水杨酸、阿魏酸、芥子酸、没食子酸）、黄酮类（槲皮素、木犀草素、芹菜素、儿茶素、表儿茶素）及二苯乙烯类白藜芦醇。定量测定证实了其丰富的酚类物质总量和黄酮含量。生物学研究表明，该提取物在DPPH、ABTS、CUPRAC（铜离子还原抗氧化能力）和铁离子还原实验中表现出适中且一致的抗氧化能力。抗菌活性具有选择性，对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）有显著抑制作用，但对大肠杆菌（E. coli）几乎无影响。观察到α-淀粉酶抑制现象，表明其具有弱至适度的代谢益处，但效力低于阿卡波糖（acarbose）。计算机模拟（In Silico）分析强化了这些发现。ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）预测表明，大多数成分具有良好的吸收和安全性特征，致突变性或致癌风险极小。分子对接（Molecular Docking）确定槲皮素、木犀草素和儿茶素为主要化合物，在抗氧化、抗菌和抗糖尿病蛋白靶点上显示出强结合亲和力，有时超过参比配体。代表性复合物的分子动力学（Molecular Dynamics）模拟证实了这些相互作用在生理条件下的稳定性。

研究背景方面，药用植物因其结构多样性、生物活性及长期的民族药理学相关性，仍是寻找新治疗制剂的基石。其中，Fagonia属物种尤其在北非和南亚地区受到越来越多的关注，被广泛用于治疗炎症性疾病、感染和代谢性疾病。Fagonia cretica L.是该属中研究较多的成员之一，因其广泛的经济性状而备受重视，其提取物据报道具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗糖尿病活性，这些效应主要归因于其酚酸、黄酮类和其他次级代谢产物。尽管其传统用途广泛，但整合植物化学轮廓分析、实验测定和计算分析的系统性研究仍然有限，特别是水提物的药理潜力尚未完全明确。目前存在的问题包括：缺乏对采自特定地理区域（如阿尔及利亚撒哈拉地区的图古尔特）的F. cretica的LC–ESI–MS/MS植物化学表征数据，以及缺乏通过整合体外与计算机模拟方法对其水提物进行表征和机制探索的研究。因此，研究人员开展此项研究，旨在调查F. cretica水提物的植物化学成分、生物活性及计算机模拟相互作用，以桥接传统用途与机制见解，从而有助于将F. cretica合理开发为生物活性试剂的来源。该研究论文发表在《ChemistryOpen》期刊上。

为开展研究，研究人员采用了几个主要关键技术方法：首先，于2023年6月从阿尔及利亚图古尔特省（33°22′ N, 6°51′ E）花期采集F. cretica L.地上部分样本，经植物学鉴定后制备水提物（50 g粉末材料在500 mL去离子水中70°C加热60 min，室温暗处浸泡48 h，过滤并减压浓缩）。其次，使用福林-酚（Folin–Ciocalteu）比色法测定总多酚含量（TPC，以没食子酸当量μg GAE/mg提取物表示），使用氯化铝比色法测定总黄酮含量（TFC，以槲皮素当量μg QE/mg提取物表示）。第三，采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC–ESI–MS/MS）技术（Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，Agilent 1260 Infinity II LC系统耦合串联质谱仪），以17种酚类参考标准品进行方法学验证（线性R2 ≥ 0.995，LOD/SNR≈3，LOQ/SNR≈10，加标回收率，日内/日间精密度RSD%，基质效应%）并定性定量分析主要代谢物。第四，通过四种体外实验评估生物活性：DPPH、ABTS、CUPRAC和铁离子还原实验评估抗氧化能力（计算IC₅₀或A_0.5）；琼脂孔扩散法及肉汤微量稀释法（MIC/MBC）评估对抗临床参考菌株（革兰氏阳性：枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌）的抗菌活性；LUGOL碘法评估α-淀粉酶抑制活性（计算IC₅₀）。第五，进行计算（In Silico）研究：从PubChem获取代谢物结构，经Open Babel和Avogadro（MMFF94力场几何优化）处理后，使用SwissADME、pkCSM和admetSAR进行ADMET与药物相似性预测；选取10种最佳性能化合物，使用AutoDock Vina v1.2.7对选定蛋白靶点（抗氧化酶：过氧化氢酶1DGF、超氧化物歧化酶1CBJ、谷胱甘肽还原酶1XAN；抗菌酶：DNA促旋酶B 6RKS、二氢叶酸还原酶1RX2、TEM-1 β-内酰胺酶1ZG4；抗糖尿病酶：人胰α-淀粉酶1HNY）进行分子对接（网格中心位于共结晶配体或活性位点，尺寸覆盖结合口袋加5–6 ?余量，exhaustiveness=16，num_modes=20，energy range=3 kcal·mol^?1），并用PLIP、PyMOL和Discovery Studio Visualizer分析；通过重对接原生共结晶配体验证对接方案（RMSD ≤ 2.0 ?）；使用GROMACS v2023进行300 ns分子动力学（MD）模拟（CHARMM36力场，CGenFF生成配体参数，TIP3P水，NVT 100 ps 300 K，NPT 100 ps 1 bar，生产运行300 ns，2 fs步长），分析RMSD、RMSF、Rg、SASA；使用gmx_MMPBSA工具进行MM-PBSA结合自由能计算（取最后100 ns轨迹，每100 ps取帧，共1000帧，计算ΔG_bind）。所有实验测定均进行三次（n=3），数据以均值±标准差表示，采用Shapiro–Wilk检验正态性，Levene检验方差齐性，单因素ANOVA及Tukey HSD事后检验（p < 0.05），并计算95%置信区间。

研究结果如下：

3.1 提取率与植物化学成分含量：水提物提取率为12.45 ± 0.28% （w/w），反映了极性化合物在水中的高溶解度。总多酚含量（TPC）为118.72 ± 0.41 μg GAE/mg提取物，总黄酮含量（TFC）为46.85 ± 0.53 μg QE/mg提取物，表明极性酚类和黄酮类化合物的有效提取。

3.2 通过LC–ESI–MS/MS进行酚类轮廓表征：LC–ESI–MS/MS分析鉴定出20种酚类及相关化合物，主要属于酚酸、黄酮、黄酮醇、黄烷-3-醇、黄烷酮、二苯乙烯和三萜类。酚酸在数量上占主导，水杨酸（峰面积4,015,746）、阿魏酸（1,620,532）、芹菜素（908,707）和芥子酸（794,651）是最丰富的成分，其次是儿茶素、杨梅素、槲皮素、白藜芦醇、表儿茶素、芦丁和齐墩果酸等。这是首次对图古尔特地区F. cretica进行基于LC–ESI–MS/MS的植物化学表征，水杨酸和阿魏酸的高丰度表明其具有区别于其他地区的化学型。

3.3 体外生物活性：

3.3.1 抗氧化活性：水提物在所有实验中均表现出较弱的抗氧化潜力，DPPH IC₅₀为185.6 ± 1.1 μg/mL，ABTS IC₅₀为92.8 ± 0.9 μg/mL，CUPRAC A_0.5为86.9 ± 1.3 μg/mL，铁离子还原A_0.5为99.7 ± 1.2 μg/mL，一致性适中，但低于标准抗氧化剂（如槲皮素、BHA），这与水提物极性溶剂提取多酚类物质的特性一致。

3.3.2 抗菌活性：水提物表现出选择性抗菌特征。最强抑制作用于金黄色葡萄球菌（13 ± 0.6 mm）和铜绿假单胞菌（12 ± 0.7 mm），其次为枯草芽孢杆菌（11 ± 0.5 mm）和藤黄微球菌（9 ± 0.4 mm）；阴沟肠杆菌活性较低（10 ± 0.0 mm），大肠杆菌完全耐药。MIC结果确认：金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌最低（6.25 mg/mL），枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌为12.5 mg/mL，阴沟肠杆菌为25 mg/mL，大肠杆菌耐药。MBC值趋势相同。革兰氏阳性菌通常比革兰氏阴性菌更敏感，可能与外膜渗透屏障有关。

3.3.3 α-淀粉酶抑制活性：在最高测试浓度（400 μg/mL）下，提取物抑制率为28.46 ± 0.42%，IC₅₀为276.84 ± 1.25 μg/mL，显示适中的抑制活性，但弱于阿卡波糖（IC₅₀= 247.31 ± 0.92 μg/mL）。

3.4 计算机辅助分析：

3.4.1 ADMET与药物相似性预测：前10种化合物的大多数表现出有利的ADMET特征：酚酸（没食子酸、阿魏酸）和黄酮苷元（槲皮素、芹菜素、木犀草素）具有高肠道通透性和非P-糖蛋白（P-gp）底物特征，表明有效吸收；白藜芦醇和阿魏酸可穿透血脑屏障（BBB）；黄酮类常显示中至高等血浆蛋白结合；部分化合物（如槲皮素、木犀草素）可抑制CYP3A4和CYP2C9，提示潜在 Herb-Drug Interaction；酚酸清除迅速，黄酮类和三萜类持久；除齐墩果酸有潜在肝毒性风险外，大多数无致突变性/致癌性信号。

3.4.2 分子对接分析：槲皮素为最强的多靶点化合物，对过氧化氢酶（1DGF）结合能为?8.5 kcal/mol，超过α-生育酚（?7.0 kcal/mol），对超氧化物歧化酶（1CBJ）、谷胱甘肽还原酶（1XAN）、DNA促旋酶B（6RKS）、二氢叶酸还原酶（1RX2）、TEM-1 β-内酰胺酶（1ZG4）和人胰α-淀粉酶（1HNY）也显示强亲和力（分别为?7.9、?7.6、?7.2、?6.8、?6.9、?7.1 kcal/mol）。木犀草素和儿茶素在抗氧化酶中也显示强亲和力。在α-淀粉酶中，槲皮素（?7.1 kcal/mol）和齐墩果酸（?6.8 kcal/mol）优于阿卡波糖（?6.0 kcal/mol）。关键相互作用包括氢键、疏水作用、π-堆叠和π-阳离子作用。

3.4.3 对接方案验证：四个蛋白靶点的重对接实验RMSD值在0.526至1.891 ?之间，小于2.0 ?的接受阈值，证实对接方案准确可靠。

3.4.4 分子动力学（MD）模拟分析：三个代表复合物（槲皮素–过氧化氢酶、儿茶素–DNA促旋酶B、槲皮素–α-淀粉酶）的300 ns MD模拟显示，骨架RMSD在最初10–20 ns内稳定，随后轻微波动；槲皮素–过氧化氢酶最稳定（RMSD极少超过0.30 nm），儿茶素–DNA促旋酶B稍高（～0.35–0.40 nm），槲皮素–α-淀粉酶中间（0.30–0.35 nm）。RMSF显示波动集中于环区和末端区，催化残基相对刚性。Rg剖面显示整个模拟过程中蛋白质 compactness，槲皮素–过氧化氢酶在200 ns后Rg略有增加，其他系统稳定在1.75–1.80 nm左右。

3.4.5 MM-PBSA结合自由能计算：槲皮素–过氧化氢酶复合物的ΔG_bind为?31.6 kcal/mol，儿茶素–DNA促旋酶B为?27.8 kcal/mol，槲皮素–α-淀粉酶为?27.0 kcal/mol，结合稳定主要由范德华和静电相互作用驱动，极性溶剂化能部分抵消结合。

讨论与结论部分总结：本工作为F. cretica L.水提物的生物活性潜力提供了新见解。LC–ESI–MS/MS轮廓揭示其富含酚酸和黄酮类（如水杨酸、阿魏酸、芹菜素、槲皮素、木犀草素、儿茶素和白藜芦醇），这些代谢物以其抗氧化、抗菌和酶抑制特性而著称，它们的存在很大程度上解释了观察到的生物活性。体外测定确认提取物具有适中但一致的抗氧化和抗菌活性，对革兰氏阳性菌影响更大，并对胰α-淀粉酶有可测量但较弱的抑制；这些生物效应与化学组成及极性酚类化合物的优势一致。计算机模拟（In Silico）分析进一步加深了理解：ADMET预测支持大多数主要代谢物的有利药代动力学行为；对接实验确定槲皮素、儿茶素和齐墩果酸为最有前景的多靶点配体；MD模拟确认这些复合物在生理条件下保持稳定，表明观察到的亲和力并非静态对接的假象；MM-PBSA结合自由能计算为选定蛋白-配体复合物的稳定性提供了定量支持，强化了计算机模拟分析的预测和机制价值，而非直接确认治疗效果。综上所述，研究结果表明F. cretica是酚类和黄酮类代谢物的宝贵来源，在氧化应激管理、微生物感染和碳水化合物代谢紊乱方面具有潜在应用。尽管水提物效力低于相关物种报道的有机馏分，但其安全性、可及性和药理学特征使其成为进一步临床前研究的候选者。未来研究应聚焦于分馏、体内实验和机制评估，以更好定义其治疗潜力。本研究确立了图古尔特种群F. cretica为一个化学上独特的化学型，并首次提供了基于LC–ESI–MS/MS和计算机模拟指导的对其生物潜力的解释。

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