基于多重靶向HILIC-HRMS的肝细胞癌循环生物标志物定量分析方法的开发与验证

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development and validation of a multiplexed targeted HILIC-HRMS assay for quantitative analysis of hepatocellular carcinoma circulating biomarkers

　　

早期且准确的肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）诊断仍是重大临床挑战，尤其在慢性丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）感染者中，传统标志物甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein, AFP）常缺乏足够的灵敏度与特异性。既往非靶向代谢组学与脂质组学研究已发现多种潜在生物标志物，但大多仅提供相对含量，未进行定量验证。为此，研究人员开发并验证了一种靶向分析方法，用于定量检测非靶向分析中筛选出的预测性生物标志物。该方法采用基于多重靶向选择离子监测（targeted Selected Ion Monitoring-Multiplexing, tSIM-MPX）策略的高效亲水相互作用色谱-高分辨质谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry, HILIC-HRMS），可在6分钟内完成血浆样本中溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholines, LPCs）与肉碱（Carnitines, CARs）的定量分析。方法学验证显示其灵敏度（平均检测限LODavg：0.0558 ng/mL，平均定量限LOQavg：0.667 ng/mL）、准确度（98.75%）、线性（决定系数R2=0.999）及稳定性（日内变异系数CV：0.39%，日间CV：1.46%）均满足要求，基质效应适中（14.8%），回收率良好（95.82%）。尽管靶向分析的变量数（24个）远低于非靶向分析（280个），该面板仍验证了此前发现的分子特征的诊断价值，并在分类性能上优于AFP。其中，LPC 14:0与LPC 18:2的区分能力最强（曲线下面积AUC分别为0.978与0.967）。该靶向方法可作为区分HCC与其他肝病的潜在工具，并通过获得循环分析物的绝对定量值，有望成为早期诊断和疗效评估的液体活检手段。

肝细胞癌（HCC）是全球范围内主要的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的75%–85%。其高危因素包括乙型肝炎病毒（HBV）与丙型肝炎病毒（HCV）感染、过量饮酒及代谢功能障碍相关性脂肪肝（MASLD）。由于早期诊断困难，多数患者在晚期才被发现，治疗选择有限，预后较差。目前临床上最常用的血清标志物甲胎蛋白（AFP）在早期HCC中的灵敏度与特异性不足，迫切需要更可靠的替代或补充标志物。近年来，基于液相色谱-质谱（LC-MS）的代谢组学和脂质组学技术在发现循环生物标志物方面取得了进展，但大多数研究停留在相对定量层面，缺乏绝对定量验证，难以转化为临床应用。因此，研究人员旨在将前期非靶向代谢组学与脂质组学筛选出的HCC相关分子特征转化为可临床应用的靶向定量检测方法，以提高诊断准确性并实现标准化。

本研究发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。研究人员开发了一种基于tSIM-MPX策略的HILIC-HRMS靶向定量方法，用于同时测定血浆中的LPCs与CARs。研究纳入92例HCV阳性受试者，其中69例为HCC患者，23例为慢性HCV感染者。样本采集自意大利国家肿瘤研究所IRCCS Fondazione G. Pascale，均在患者接受治疗前收集并储存于?80℃。关键技术方法包括：优化样品制备流程，比较固相萃取（SPE）与有机溶剂沉淀法，最终选择冰乙腈沉淀以获得最佳回收率；优化HILIC色谱条件，选用BEH Amide色谱柱，调整流动相组成与梯度，实现LPCs区域异构体的分离；采用tSIM-MPX高分辨质谱采集模式，提高灵敏度和峰采样点数量；按照国际人用药品注册技术要求协调会（ICH）指南完成方法学验证，包括线性、灵敏度、精密度、准确度、基质效应、回收率及稳定性评估；使用主成分分析（PCA）与偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行数据建模，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评估单个代谢物的诊断效能。

研究结果

研究人群特征：HCC组与慢性HCV组在性别比例与年龄分布上存在差异，HCC患者多为男性且年龄较大。生化指标显示ALT与GGT升高，而AST与AFP无显著差异，且AFP水平与肿瘤特征无相关性，进一步支持其诊断局限性。

样品制备优化：比较SPE与溶剂沉淀法，发现SPE对不同类别代谢物的回收率差异显著，而冰乙腈沉淀法的平均回收率达95.82%，优于甲醇沉淀法（60.21%），并获得更好的色谱峰形。

色谱条件优化：在HILIC模式下，采用含10 mM乙酸铵的流动相可获得最佳峰形与信号强度，相比其他添加剂提升显著；将样品重悬溶剂的乙腈比例从70%提升至80%，避免了峰分裂并增强柱头聚焦效果；优化后的方法实现了LPCs区域异构体的基线分离，并通过MS/MS碎片离子确认结构。

质谱采集模式选择：比较全扫描数据依赖采集（FS-DDA）、选择离子监测（SIM）与tSIM-MPX模式，tSIM-MPX在峰采样点数量、灵敏度与重现性方面表现最优，尤其适用于低丰度代谢物检测。

方法学验证：该靶向HILIC-HRMS方法符合ICH验证要求，LOD_avg为0.0558 ng/mL，LOQ_avg为0.667 ng/mL，线性R²=0.999，日内与日间CV分别仅为0.39%与1.46%，基质效应为14.8%，回收率为95.82%。交叉定量验证显示平均误差为8.5%。

HCC中LPCs与CARs的差异分析：PCA结果显示HCC与HCV样本在第一主成分上明显分离，LPCs在HCC中普遍降低，CARs则呈链长依赖性变化。PLS-DA模型在训练集与交叉验证中准确率达100%，独立测试集准确率为96.43%。ROC分析表明LPC 14:0（AUC=0.978）与LPC 18:2（AUC=0.967）具有最强的诊断能力，而CARs的整体贡献较低且部分呈反向调控。

讨论与结论

本研究成功将非靶向发现的HCC相关代谢特征转化为经过验证的靶向定量检测方法，解决了相对定量无法支持临床转化的瓶颈。冰乙腈沉淀结合HILIC分离与tSIM-MPX采集，实现了高通量、高灵敏度、高稳定性的LPCs与CARs绝对定量。研究证实，LPCs显著降低与CARs的链长特异性变化反映了HCC的代谢重塑特征，尤其是线粒体β-氧化异常与膜磷脂周转加速。与AFP相比，该靶向面板在HCC与慢性HCV感染者的区分中具有更高的准确性，尤其在AFP阴性病例中具有重要应用潜力。尽管样本量较小且未纳入健康对照，但结果已在独立测试集中得到验证，显示出作为非侵入性液体活检工具的广阔前景。该方法为HCC的早期筛查、疗效监测及疾病分型提供了可靠的分析平台，也为其他肿瘤的代谢组学转化研究提供了参考范式。