通过空间限制和级联材料扩增技术实现结核分枝杆菌尿液ESAT-6抗原的均质免疫测定

《Biosensors and Bioelectronics》：Mycobacterium tuberculosis urine ESAT-6 antigen homogeneous immunoassay through spatial confinement and cascade material amplification

　　

姜鹏军|熊颖|胡汉佳|金亚雄|彭武|陈飘飘

四川大学华西医院医学与工程整合分子诊断研究所临床实验室医学研究中心Med+X制造中心实验室医学系，中国四川省成都市610041

摘要

结核病（TB）仍然是传染性疾病导致死亡的主要原因之一。早期分泌抗原靶标6（ESAT-6）是活动性结核分枝杆菌感染的特异性生物标志物；然而，在尿液样本中对其进行超高灵敏度检测仍然具有挑战性。本文报道了一种基于空间限制介导的DNA构象切换与级联信号放大的均匀免疫测定方法来检测ESAT-6。该系统利用C-Ag⁺-C配位作用稳定的抗体结合的三联体DNA分子；特异性抗原结合会引发构象变化，从而破坏复合物，释放出Ag⁺，并与CuS纳米颗粒（NPs）发生阳离子交换反应（CER），生成Cu²⁺，并能够有效地抑制CdTe量子点（QDs）的发光。这一均匀平台无需洗涤步骤或基于酶的放大，检测限可达30 ag/mL，线性范围为0.1-100 fg/mL。使用80份尿液样本（40份结核病阳性样本和40份阴性样本）进行临床验证，结果显示两组间差异显著（p < 0.001），接收者操作特征分析也证实了其强大的诊断性能。ESAT-6检测结果与影像学发现高度一致，并与酶联免疫吸附测定结果具有强相关性。该系统提供了一种基于尿液的快速结核病诊断工具，显著降低了操作复杂性，满足了临床需求。

引言

结核病（TB）仍然是全球由单一传染源导致的最大死亡原因之一，2024年估计约有1070万新发病例和120万人死亡，其中负担主要集中在30个高负担国家（Chiang等，2025）。特别是在肺外结核病和儿童群体中，持续的诊断差距突显了快速准确检测方法的迫切需求，尤其是基于痰液的检测方法（Scott等，2026）。最近，基于尿液的检测方法因其便捷性和可靠性而成为传统样本类型的宝贵补充（Jiang等，2025）。在尿液生物标志物中，早期分泌的抗原靶标6（ESAT-6）是一种有前景的诊断生物标志物，因为它存在于卡介苗株和大多数非结核分枝杆菌中，能够区分活动性结核病与其他分枝杆菌感染（Jha等，2020；Lu等，2025）。已经开发了许多检测ESAT-6的方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、基于CRISPR的系统、质谱和纳米孔生物传感（Bell等，2025；Chen等，2023b；Fossati等，2025；Huang等，2023；Liu等，2017；Liu等，2025；Omar等，2021；Wang等，2023a；Xia等，2023；Xie等，2021；Zuo等，2024）。然而，这些方法大多依赖于特异性抗体，需要多次洗涤步骤、电极修饰或专用仪器，并且对易获取的样本适用性有限。因此，仍需一种快速、高灵敏度的基于尿液的结核病检测方法。

均匀免疫测定方法通过消除洗涤步骤提供了独特的优势，满足了简单性的需求（Akama等，2019；Ni等，2021；Zhang等，2025）。然而，这些系统往往因背景信号高和信号放大有限而灵敏度不足。这些挑战的核心在于均匀免疫系统中缺乏对次级抗体的额外标记或修饰，限制了目标信号的充分获取或噪声降低（Zhu等，2025）。DNA纳米材料因其精确的可编程性而受到广泛关注，提供了一种无需增加系统复杂性的解决方案。先前的研究表明，合理设计的DNA纳米材料中的目标诱导构象变化可以作为有效的分子开关参与信号转导（Jia等，2025；Martinez-Fernandez等，2024）。例如，金属离子介导的DNA配位，包括C-Ag⁺-C和T-Hg²⁺-T不匹配复合物，可以在目标触发释放之前稳定信号（He等，2024a；Okamoto等，2009；Porchetta等，2013）。在抗原-抗体免疫结合后，产生的空间限制和立体阻碍可以诱导DNA双链的结构重排，破坏相邻的双链DNA（dsDNA），并释放金属离子（Feng等，2023；Li等，2013；Ranallo等，2017；Woodside等，2006）。为了进一步提高灵敏度，金属离子可以与半导体纳米颗粒（NPs）（如CuS NPs和CdTe量子点（QDs）发生阳离子交换反应（CER），产生放大的信号变化（He等，2024b；Wang等，2023b）。这种级联机制将单个抗原-抗体结合事件放大为显著增强的信号输出，从而克服了传统均匀免疫测定的灵敏度限制。

本文报道了一种基于空间限制诱导的DNA构象切换和级联CER放大的超高灵敏度尿液ESAT-6检测方法。该系统利用C-Ag⁺-C配位作用稳定的抗体结合的三联体分子。生物素-链霉亲和素（SA）系统特异性抗原结合会引发构象变化，破坏这些复合物，释放出Ag⁺，与CuS NPs和CdTe QDs发生连续的阳离子交换，导致高效的荧光抑制。这种完全均匀的平台消除了洗涤步骤和额外的核酸放大，使得可以定量尿液中低丰度的ESAT-6。临床验证显示结核病阳性和阴性组之间的区分度很高，结果与ELISA的结果高度一致。简化的检测流程（45分钟）和高灵敏度及准确性显著降低了操作复杂性，并最小化了设备依赖性，显示出在资源有限环境中快速诊断结核病的强大潜力。

小节片段

ESAT-6的分析步骤

为了通过C-Ag⁺-C配位构建稳定的三联体dsDNA，将4 μL 10 μM C1（最终浓度：0.23 μM）、12 μL 10 μM HP（最终浓度：0.68 μM）和19.2 μL 50 μM AgNO₃（最终浓度：5.4 μM）与100 μL 10 mM 3-(N-morpholino)丙磺酸（MOPS）缓冲液（100 mM NaNO₃，pH 7.4）混合，在室温下避光孵育30分钟。随后，加入5 μL 250 μg/mL SA（最终浓度：7.1 μg/mL）和2 μL 100 μg/mL生物素化抗ESAT-6

尿液ESAT-6抗原均匀免疫测定的原理

我们开发了一种利用空间限制和级联材料放大来检测尿液中ESAT-6的均匀免疫测定方法（图1）。首先，对结核病患者的尿液样本进行离心并稀释以准备ESAT-6分析物（图1A）。合成了一个三联体dsDNA结构，包括两端带有生物素修饰的富含C的C1链和三个发夹（HP）链，每个HP链的两端各含有四个连续的C碱基，形成8个C-Ag⁺-C碱基对

结论

在这项研究中，我们开发了一种利用空间限制和级联材料放大来检测结核病患者尿液样本中ESAT-6抗原的均匀免疫测定方法。该方法基于通过C-Ag⁺-C配位稳定的合理设计的抗体锚定三联体DNA结构。特异性抗原识别会诱导DNA复合物的构象变化，释放出Ag⁺离子，触发与CuS NPs和CdTe QDs的连续CER。这使得有效的

CRediT作者贡献声明

胡汉佳：撰写——原始稿件，数据管理。熊颖：撰写——原始稿件，资源管理，数据管理。姜鹏军：撰写——原始稿件，数据管理。陈飘飘：撰写——审阅与编辑，监督，资金筹集。彭武：撰写——审阅与编辑，监督。金亚雄：撰写——原始稿件，资源管理

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

注释

作者声明没有已知的竞争性财务利益。

利益冲突声明

■作者声明没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了新发和重大传染病的预防与控制-国家科学技术重大项目（2026ZD01911300）、四川省科技计划（2024YFFK0306）、国家呼吸健康与多病因重点实验室的1·3·5项目（华西医院，（RHM24201）以及Med-X制造中心（华西医院，0040206107105）的支持。我们感谢Home for Researchers（www.home-for-researchers.com