《Biosensors and Bioelectronics》：A Portable Cas13a Self-Cascading Cyclic Amplification-Integrated System Enables Multiple Respiratory Tract Viruses Analysis Within Minutes at Point-of-Needs
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基于CRISPR的分子检测系统通常需要预扩增步骤以达到足够的灵敏度，但这会延长反应时间，并增加非特异性扩增、引物干扰和气溶胶污染的风险。本研究开发了一种基于LbuCas13a的自级联循环扩增检测方法（SCC-Cas13a），可在无需预扩增的情况下同时检测多种呼
基于CRISPR的分子检测系统通常需要预扩增步骤以达到足够的灵敏度，但这会延长反应时间，并增加非特异性扩增、引物干扰和气溶胶污染的风险。本研究开发了一种基于LbuCas13a的自级联循环扩增检测方法（SCC-Cas13a），可在无需预扩增的情况下同时检测多种呼吸道病毒。该方法的实现依赖于设计靶向特定病毒RNA序列的CRISPR RNA（crRNA）以及含有多重尿嘧啶结构的发夹探针（HP）。当crRNA与目标RNA发生序列特异性杂交时，会激活LbuCas13a的反式切割活性，使其切割HP富含多聚尿嘧啶的茎环区域，从而释放出与靶RNA序列一致的单链RNA激活剂。这些释放的激活剂可触发新一轮的序列特异性杂交，形成自级联循环扩增。在概念验证实验中，研究人员在3分钟内实现了呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒（Flu A）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的检测，检测限（LOD）分别达到230 aM、310 aM和420 aM，较传统CRISPR系统提升了104倍。SCC-Cas13a省去了逆转录和预扩增步骤，将工作流程简化为一步反应。此外，研究人员设计了径向微流控芯片（R-chip）集成该SCC-Cas13a系统，用于临床鼻咽拭子样本中上述三种病毒的同步检测。结合能够稳定激发并精确采集R-chip荧光信号的智能手机设备，本研究为资源有限环境下的多重病原体识别和精准分子诊断提供了一种创新解决方案。
便携式CRISPR-Cas13a自级联扩增系统在呼吸道病毒即时检测中的应用研究
呼吸道病毒因其高传播性和致病性，对全球公共卫生构成持续威胁，尤其对儿童、老年人及免疫功能低下人群造成显著健康风险。传统实验室检测依赖集中式高成本仪器，样本运输与实验室处理导致周转时间延迟，且在人群聚集场所存在交叉感染风险。即时检测（POCT）平台虽能通过“样本进-结果出”的工作流程在基层医疗机构和暴发点提供精准筛查，但现有技术仍面临瓶颈：胶体金免疫层析法速度快但灵敏度不足，易出现假阴性或假阳性；基于定量聚合酶链式反应（qPCR）和等温扩增（如RPA、LAMP）的核酸检测技术虽提升了特异性，却因多引物使用和持续加热需求增加了试剂复杂性和能耗，且非特异性扩增产物可能影响可靠性。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）系统凭借高灵敏度和特异性成为分子诊断的重要工具，但现有CRISPR检测平台大多仍需核酸预扩增，不仅增加了工作流程复杂性，也带来了气溶胶污染风险。尽管已有部分无预扩增CRISPR平台取得进展，但仍普遍存在检测限（LOD）多在飞摩尔（fM）级别以上、反应时间超过10分钟、缺乏集成化多重检测能力等局限。针对这些挑战，中山大学研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表研究，开发了基于LbuCas13a的自级联循环扩增检测方法（SCC-Cas13a），并构建了集成化的便携式POCT平台。
研究人员在开展研究过程中，主要采用了三个关键技术方法：一是设计包含多重尿嘧啶结构的发夹探针（HP）和特异性crRNA，构建SCC-Cas13a反应体系；二是开发具有11个反应室的径向微流控芯片（R-chip）用于多重并行检测；三是搭建基于智能手机的荧光信号激发与采集装置。研究使用的临床样本为鼻咽拭子样本队列，用于验证平台的实用性和准确性。
在SCC-Cas13a验证部分，研究人员通过优化反应条件，成功验证了该系统的可行性。结果显示，SCC-Cas13a能够在无需逆转录和预扩增的情况下，实现对病毒RNA的快速检测，反应时间缩短至3分钟。
在传感机制部分，研究阐明了SCC-Cas13a的工作原理：crRNA与目标RNA的序列特异性杂交诱导LbuCas13a核糖核蛋白复合物发生构象重排，激活其反式切割活性，切割HP的多聚尿嘧啶茎环区域，释放出与靶RNA序列相同的单链RNA激活剂，进而触发新一轮循环扩增，实现信号的自级联放大。
在结论部分，研究人员总结了该POCT平台的性能：该平台集成了SCC-Cas13a检测模块、R-chip多室并行检测模块和智能手机信号采集系统，可在5分钟内完成从样本加载到结果读取的全过程（包括1分钟混合加载、3分钟反应和1分钟数据分析），对RSV、Flu A和SARS-CoV-2的临床检测总体准确率达0.94，单次检测成本约为1.5美元。该平台操作简便，即使非专业人员也可稳定使用。
讨论部分指出，虽然该系统实现了超灵敏、快速、低成本的多重病原体现场检测，但目前的样本预处理步骤仍依赖离心机等外部设备，且反应试剂的稳定性有待进一步提升。研究结论强调，这种便携式POCT平台为资源有限地区的呼吸道感染防控提供了强有力的技术支撑，具有重要的临床应用价值和公共卫生意义。
