《Toxicon》：Tigrin, a venom-derived cysteine-rich secretory protein from Rhabdophis tigrinus, triggers interleukin-8 release from endothelial cells
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长泽京子（Kyoko Hasuwa）|井上信博（Noboru Inoue）|樱井良彦（Yoshihiko Sakurai）|结城胜也（Katsuya Yuui）|工藤里沙（Risa Kudo）|松本正典（Masanori Matsumoto）|藤村良宏（Yoshihiro Fuj
长泽京子（Kyoko Hasuwa）|井上信博（Noboru Inoue）|樱井良彦（Yoshihiko Sakurai）|结城胜也（Katsuya Yuui）|工藤里沙（Risa Kudo）|松本正典（Masanori Matsumoto）|藤村良宏（Yoshihiro Fujimura）|笠田翔吾（Shogo Kasuda）
奈良医科大学法医学系，日本奈良县柏原市四条町840，邮编634-8521
摘要
Tigrin是一种从Rhabdophis tigrinus毒液中分离出的蛋白质，与蛇毒中的半胱氨酸富集分泌蛋白（CRISPs）具有同源性；然而，其生物学功能尚未得到充分了解。本研究旨在探讨tigrin是否会在人类内皮细胞和单核细胞中诱导促炎细胞因子的产生。Tigrin从R. tigrinus的粗毒液中纯化，并通过SDS–PAGE技术进行了鉴定。人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）和THP-1单核细胞被粗毒液或纯化的tigrin刺激。通过定量聚合酶链反应（PCR）分析了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平，并通过ELISA检测了IL-6、IL-8、冯维勒布兰德因子（VWF）和P-选择素的蛋白分泌情况。粗毒液在两种细胞类型中均增加了IL-8的mRNA和蛋白表达，且在HUVECs中的效果更为显著。纯化的tigrin以剂量依赖的方式诱导了HUVECs的IL-8分泌；然而，它并未刺激IL-6、VWF或P-选择素的分泌。Tigrin激活了p44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，抑制该通路可抑制IL-8的产生。这些发现表明tigrin可能通过Weibel–Palade小体选择性地释放IL-8。研究表明，富含tigrin的成分能够在内皮细胞中选择性诱导IL-8的分泌。Tigrin可能增强局部炎症，并与R. tigrinus毒液的促凝作用协同作用。这些发现为蛇毒CRISP的生物学特性及毒液诱导的炎症反应提供了新的见解。
引言
与Gloydius blomhoffii（ mamushi）一样，Rhabdophis tigrinus（yamakagashi）也是日本最具代表性的毒蛇之一。R. tigrinus具有两种类型的毒液。一种毒液是通过摄取Bufo japonicus蟾蜍获得的，其毒素被吸收并储存起来。R. tigrinus颈部有一个称为颈腺（nuchal gland）的特殊结构，该结构会积累来自蟾蜍的心脏类固醇——蟾蜍甾醇（bufadienolides）。它从颈部释放含有毒素的液体（Hutchinson等人，2007年）。另一种毒液是由蛇自身产生的内源性蛋白质毒素，储存在某些游蛇科（colubrids）特有的杜韦诺伊腺（Duvernoy's gland）中。这种毒液主要通过激活人体凝血酶原而表现出强烈的促凝作用（Sakai等人，1983年）。与其他毒蛇类似，R. tigrinus的毒液含有复杂的生物活性成分。
已从粗毒液中分离出多种成分，其中一些成分的初级结构已被确定。Tigrin是一种25-kDa的蛋白质（Komori等人，2017年），其与哺乳动物中的半胱氨酸富集分泌蛋白（CRISPs）具有约50%的序列同源性（Yamazaki和Morita，2004年）。尽管大多数蛇毒中都含有蛇毒CRISPs（svCRISPs），但迄今为止只有少数几种被功能性地研究过（Aird等人，2013年）。CRISPs通常不是主要的毒性成分，且往往不具有致命性，但它们在毒液中的广泛存在表明它们可能具有功能性作用。
由于R. tigrinus粗毒液的主要作用是增强血液凝固性，tigrin也可能参与调节Virchow三联征——即血流停滞、内皮损伤和高凝状态——在这些过程中血管和血液成分都起着关键作用。因此，作为细胞因子产生的主要来源，内皮细胞和单核细胞值得特别关注。
三十多年来，研究人员一直在研究蛇毒成分是否通过其生物活性影响细胞因子的产生（Lomonte等人，1993年）。蛇毒分泌的磷脂酶A2（Sampat等人，2023年；Xiao等人，2017年）和金属蛋白酶（Fox和Serrano，2008年；Teixeira等人，2005年）在炎症和细胞因子诱导中的作用已得到充分证实。此外，某些svCRISPs也被证明可以调节细胞因子的产生（Salazar等人，2024年）。基于这些发现，我们假设tigrin可能会影响单核细胞和血管内皮细胞的细胞因子释放，因此进行了相关研究。
章节摘录
Tigrin的纯化
Tigrin的纯化采用了之前报告中描述的方法（Inoue等人，2026年）。从日本蛇类研究所（日本群马县太田市）购买了R. tigrinus的冻干毒液。将20毫克的粗毒液溶解在4毫升50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，然后应用于Sephacryl S-200 HR柱（1.5 × 80 cm；Cytiva，Amersham，英国）。柱子用相同的缓冲液预平衡，直至达到稳定的基线值。色谱分析...
Tigrin的纯化和鉴定
将R. tigrinus的粗毒液应用于Sephacryl S-200 HR柱，得到了两个主要峰和两个次要峰（补充图S1A）。第二个主要峰没有促凝活性，被收集后应用于羟基磷灰石柱（补充图S1B）。在预洗脱部分观察到一个峰，这些样本被合并后进行了SDS–PAGE分析。在还原条件下，纯化的蛋白质显示出了相应的分子量条带...
讨论
在本研究中，我们证明了从Rhabdophis tigrinus中提取的纯化tigrin能够通过MAPK通路强烈刺激血管内皮细胞分泌IL-8。
虽然CRISPs通常不是蛇毒的主要成分，但它们广泛存在于多种蛇类中（Aird等人，2013年；Yamazaki和Morita，2004年）。许多svCRISPs已知可以抑制离子通道并抑制血管生成。此外，大多数svCRISPs是L型Ca2+通道...
结论
我们的研究发现，从R. tigrinus中提取的tigrin能够诱导血管内皮细胞分泌IL-8——这一功能此前尚不清楚。这种由IL-8介导的反应可能增强局部炎症，并进一步促进血液凝固，这是R. tigrinus毒液的主要作用。
伦理声明
本研究未涉及人类受试者的使用。
本研究未进行任何动物实验。
资助
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。
长泽京子（Kyoko Hasuwa）：概念构思、数据管理、数据分析、实验设计、可视化、初稿撰写。井上信博（Noboru Inoue）：数据管理、数据分析、实验设计、初稿撰写。樱井良彦（Yoshihiko Sakurai）：概念构思、监督、验证、审稿与编辑。结城胜也（Katsuya Yuui）：数据分析、实验设计、审稿与编辑。工藤里沙（Risa Kudo）：数据分析、实验设计、审稿与编辑。松本正典（Masanori Matsumoto）：方法学设计、验证、审稿与编辑。
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
