一种CRISPR-Cas12a系统与金属增强型荧光适配体-荧光团纳米报告器相结合的技术，用于超灵敏检测前列腺特异性抗原

《Biosensors and Bioelectronics》：A CRISPR-Cas12a System Integrated with Metal-Enhanced Light-up Aptamer-Fluorophore Nanoreporter for Ultrasensitive Detection of Prostate-Specific Antigen

　　

贾向燕|孟晓|关海威利斯何|朱静怡|张琴|肖舒|尹博涵|顾冰|黄秀宏德克斯特|杨莫

香港理工大学生物医学工程系，中国香港999077

摘要

在这项研究中，我们开发了一种基于CRISPR-Cas12a的生物传感系统，该系统结合了金属增强型荧光适配体（MELAF）纳米报告器，用于超灵敏地检测前列腺特异性抗原（PSA）。MELAF纳米报告器采用核壳结构，由金纳米棒核心、银内壳、介孔二氧化硅间隔层以及表面连接的荧光适配体-荧光团复合物组成，实现了级联荧光增强。这种级联荧光增强通过两个阶段实现：（i）适配体-荧光团结合限制了分子内旋转，从而激活荧光团的发射；（ii）经过光谱和空间优化的Au@Ag核壳结构提供了等离子体放大效应，进一步增强了荧光信号。在PSA存在的情况下，PSA特异性适配体会优先结合抗原，从而阻止CRISPR-Cas12a系统的激活，保持纳米报告器的“开启”荧光状态。在没有PSA的情况下，未结合的PSA特异性适配体会激活CRISPR-Cas12a系统，导致MELAF纳米报告器的切割，同时消除荧光效应和等离子体放大效应，导致荧光显著减弱。作为概念验证，该平台能够快速（约75分钟）且高度灵敏地检测PSA，检测限为0.36 pg/mL。该检测方法在复杂的生物基质中表现出优异的特异性和稳健性，临床样本的测量结果也证明了其高准确性和诊断价值。

引言

近年来，纳米技术和生物传感平台的结合极大地提升了检测性能。其中，金属增强荧光（MEF）作为一种增强荧光传感器灵敏度的强大方法而脱颖而出（Lee等人，2019；Luan等人，2020）。MEF已在多种生物传感平台中得到应用，显著降低了检测限，例如侧向流动免疫测定（Hong等人，2023）、荧光免疫吸附测定（Luan等人，2020）和流式细胞术（Palacios等人，2021）。这些成就凸显了MEF的多功能性及其在提升诊断能力方面的潜力。与此同时，成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白（CRISPR-Cas）系统彻底改变了核酸检测方法，其中Cas12a主要用于DNA目标，Cas13a用于RNA目标（Wu等人，2025；Yan等人，2025；Yin等人，2022）。值得注意的是，结合MEF的CRISPR-Cas检测平台在目标阴性和阳性样本之间的信号区分方面表现出显著增强，从而提高了灵敏度，而无需核酸扩增（Choi等人，2020）。尽管CRISPR-Cas系统对核酸目标具有极高的灵敏度，但由于缺乏直接识别机制，其在蛋白质检测中的应用仍然具有挑战性。目前的CRISPR基蛋白质检测策略通常需要信号转导步骤，如别构适配体调节或链置换电路（Spezzani等人，2025；Xiong等人，2019）。尽管取得了这些进展，但在提高特异性、最小化背景信号和简化检测流程方面仍存在挑战（Cheng等人，2022）。

荧光适配体是通过指数富集法（SELEX）系统进化得到的DNA或RNA序列，当它们与其相应的非荧光荧光团结合时，会引发荧光强度的显著增加（Swetha等人，2020；Tuerk & Gold，1990）。这种荧光增强机制包括分子内旋转的限制（RIR）、分子内淬灭剂的释放或从螺内酯状态到开放形式的平衡转变，确保了高效的信号生成（Osman等人，2024；J. Zhang等人，2021）。这些荧光适配体-荧光团（LAF）复合物具有多个优势，包括无需标记的检测（Neubacher & Hennig，2019；Shelke等人，2018）、增强的可编程性和高信噪比（Kolpashchikov & Spelkov，2021），使其成为生物传感应用中的有前景的分子工具。尽管具有这些潜力，荧光适配体仍面临一些挑战。例如，最近的一项研究引入了一种利用荧光适配体信号传导CRISPR-Cas13a检测活病原细菌的方法（T. Zhang等人，2021），但RNA适配体在生物传感平台中的内在不稳定性引发了关于假阳性结果的担忧。为克服这一限制，开发了一种新的方法，利用CRISPR/Cas9介导的荧光适配体转录检测，实现高效、无需洗脱的DNA检测（Song等人，2023）。此外，一种级联的、无标记的CRISPR/Cas12a系统结合了DNA酶和分裂的DAP-10，实现了对结直肠癌筛查中甲基化Septin9基因的灵敏检测，检测限达到1.74 nM（Tian等人，2025）。然而，当荧光适配体-荧光团复合物用作信号报告器时，其荧光强度仍然是检测灵敏度的限制因素。为了解决这一挑战，将荧光适配体与金属纳米材料结合以利用MEF效应是一种有前景的策略，旨在通过利用DNA相对于RNA的更高稳定性和MEF效应提供的信号放大能力来提高灵敏度。

在这项研究中，我们开发了一种基于CRISPR-Cas12a的生物传感系统，结合了MELAF纳米报告器，用于超灵敏地检测PSA。MELAF纳米报告器由金纳米棒核心、银内壳、介孔二氧化硅间隔层以及连接在金属结构表面的荧光适配体-荧光团复合物组成，实现了来自DNA适配体-荧光团复合物的荧光级联增强和来自金属结构的等离子体增强。第一级增强是由于Auramine O（AO）特异性适配体限制了非荧光AO分子的分子内旋转，有效抑制了非辐射能量损失，允许荧光发射（图1A）（J. Zhang等人，2021）。第二级增强源于mSiO₂包覆的Au@Ag核壳纳米结构的等离子体放大效应，通过调节二氧化硅壳层的厚度以实现最佳等离子体耦合距离，并调整银壳层的厚度以实现光谱重叠，进一步增强了LAF荧光信号（图1B）。该机制基于“保护介导的信号保留”策略（图1C）。在没有目标PSA的情况下，Cas12a系统被激活，像分子剪刀一样切割荧光报告器，使信号熄灭（“关闭”）。然而，当PSA与其特异性适配体结合时，它会有效地“锁定”激活剂DNA，从而防止Cas12a的激活，保护MELAF纳米报告器免受降解，并保持强烈的金属增强荧光（“开启”）。这种基于MELAF的平台能够高度灵敏地检测PSA，在75分钟内达到0.36 pg/mL的检测限，具有优异的特异性和准确性。该系统在临床样本中表现出对PSA的灵敏和特异性检测的稳健性能。由于下游检测依赖于Cas12a介导的切割，因此无需为每种新分析物重新设计MELAF纳米报告器。这种方法通过简单地更换初始识别适配体，使生物传感器能够快速适应各种目标，包括病毒抗原或小分子。

部分摘录

ARSS@LAF的制备

为了最大化ARSS@LAF纳米报告器的这种效应，我们优化了两个关键纳米结构组件：Ag壳层和介孔二氧化硅间隔层。实验证据表明，要实现最大的荧光增强，需要精确对齐金属纳米粒子的局域表面等离子体共振（LSPR）与荧光团的吸收和发射光谱（Lu等人，2011）。因此，我们使用Ag壳层涂层来调整LSPR峰值，使其与

结论

在这项研究中，我们开发了一种新型的金属增强型荧光适配体生物传感器，通过利用CRISPR-Cas系统的识别和放大能力显著提高了检测灵敏度。在该系统中，MELAF报告器使用了Au@Ag核壳金属纳米结构，并通过介孔二氧化硅涂层作为间隔层进行距离调节，从而显著增强了荧光适配体的荧光。通过精确地

CRediT作者贡献声明

孟晓：验证。贾向燕：撰写——原始草稿，方法学。朱静怡：验证，数据管理。关海威利斯何：方法学。肖舒：研究。张琴：研究。顾冰：验证。尹博涵：监督。杨莫：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。黄秀宏德克斯特：监督

Zhang等人，2021。

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。本研究中使用的临床样本来自广东省人民医院，作者确认作者与样本提供者之间没有可能被视为潜在利益冲突的财务或个人关系。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。本研究中使用的临床样本来自广东省人民医院，作者确认作者与样本提供者之间没有可能被视为潜在利益冲突的财务或个人关系。

致谢

本工作得到了香港研究资助委员会（RGC）合作研究基金（C5005-23W）、研究资助委员会（RGC）香港一般研究基金（15217621和15216622）、香港理工大学内部基金（1-YWB4、1-WZ4E、1-CD8M、1-WZ4E、1-CEB1、1-YWDU、1-CE2J、1-CDKU和1-W02C）的支持。W.S.H.D.感谢国家自然科学基金青年科学家基金（编号：32501158）和泰山学者青年专家的支持