基于RPA-CRISPR/Cas12a的肺炎克雷伯菌及耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌临床与食品安全场景可视化检测平台

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Visual detection platform based on RPA-CRISPR/Cas12a for Klebsiella pneumoniae and Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in clinical and food safety settings

　　

引言：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)与耐碳青霉烯类KP(Carbapenem-resistant KP, CRKP)的流行对公共卫生与食品安全构成严重威胁，开发快速即时检测(Point-of-care testing, POCT)技术迫在眉睫。传统检测方法受限于实验室条件，难以满足POCT需求。 方法：研究人员开发了单管一体化重组酶聚合酶扩增(Recombinant polymerase amplification, RPA)与CRISPR/Cas12a检测体系，用于KP及携带blaOXA-48基因的CRKP的快速、灵敏、特异性检测。针对KP特异性rpoB基因与碳青霉烯耐药基因blaOXA-48设计特异性引物，经琼脂糖凝胶电泳筛选最优引物对；依据RPA扩增产物设计crRNA序列，优化CRISPR/Cas12a反应组分，先后建立两步法反应体系与一体化单管RPA-CRISPR/Cas12a检测体系。采用微生物培养与定量实时荧光PCR(qPCR)作为参考方法，对66份临床标本及人工污染食品样本进行方法学验证。 结果：两步法体系对菌悬液的检测限达100 CFU/mL；单管体系可在37°C条件下1小时内完成检测，避免气溶胶污染，支持蓝光下可视化判读。验证试验中，单管体系的检测结果与微生物培养、qPCR完全一致。 讨论：本研究构建了双靶标RPA-CRISPR/Cas12a平台，可在蓝光下实现KP与blaOXA-48阳性CRKP的可视化检测，降低了对精密仪器与专业人员的依赖，有望成为临床诊断与食品安全监测的POCT工具，为及时制定合理抗菌治疗策略提供依据。

本研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》，聚焦于肺炎克雷伯菌(KP)与耐碳青霉烯类KP(CRKP)的快速检测难题。KP是一种广泛定植于畜禽、污染零售肉品蔬菜并可寄生于人类呼吸道与肠道的革兰阴性杆菌，免疫力下降时可引发肺炎、尿路感染、败血症及脑膜炎等疾病。近年来抗生素滥用导致KP耐药问题日益突出，CRKP已成为全球重大公共卫生威胁，中国细菌耐药监测网数据显示KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率已从2005年的3.0%升至2024年的22%。现有检测方法中，传统培养与药敏试验耗时长、操作繁琐且依赖精密设备，定量实时荧光PCR(qPCR)虽灵敏度高但需昂贵热循环仪，均难以在基层与现场推广。前期研究显示连云港地区CRKP主要携带bla_OXA-48型碳青霉烯酶基因，因此针对该靶标开发适配即时检测(POCT)需求的双靶标体系具有重要现实意义。

研究人员开发了一种整合重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a技术的单管一体化检测平台，核心关键技术包括：基于rpoB内源基因与bla_OXA-48耐药基因设计特异性RPA引物与crRNA，通过琼脂糖凝胶电泳筛选最优引物对并优化反应条件；构建两步法与单管法两种反应体系，单管体系利用液层表面张力实现组分隔离以避免开盖气溶胶污染；采用蓝光激发荧光探针实现可视化判读；以2025年1月至6月采集的66份临床标本（含痰、尿、支气管肺泡灌洗液）及人工污染的肉类、牛奶、海水、小鼠垫料等食品环境样本开展验证，并以微生物培养与qPCR作为参考标准。

研究结果分为以下部分：

3.1 RPA引物筛选与反应条件优化：针对rpoB与bla_OXA-48各设计5组RPA引物，通过碱基错配优化消除引物二聚体，最终筛选出扩增效率最高且无杂带的rpoB引物对3与bla_OXA-48引物对2；确定最佳反应条件为37°C恒温反应25分钟，引物浓度10 μM，该条件下引物特异性良好，与其他常见病原菌无交叉反应。

3.2 Cas12a蛋白切割活性验证与CRISPR/Cas12a反应条件优化：设计的crRNA可引导Cas12a特异性识别RPA扩增产物并激活反式切割活性，仅含对应靶标的反应管可见明显荧光；通过浓度梯度实验确定最佳反应组分为500 nM单链DNA(ssDNA)探针、50 nM Cas12a蛋白与50 nM crRNA，兼顾灵敏度与经济性。

3.3 CRISPR/Cas12a体系特异性与灵敏度评估：该体系仅对KP及携带bla_OXA-48的基因型菌株产生荧光信号，无其他病原体交叉反应；对KP与CRKP菌悬液的检测限可达10²CFU/mL。

3.4 单管RPA-CRISPR/Cas12a体系构建：通过液层分层与表面张力实现反应组分临时隔离，反应时倒置混匀即可启动全流程，无需开盖；对纯菌悬液的检测限为10³CFU/mL；在肉类、牛奶等真实样本中因基质干扰，检测限降至10⁴CFU/mL，后续需优化前处理流程。

3.5 单管体系应用验证：66份临床标本检测显示，26份为KP阳性，其中6份为bla_OXA-48阳性CRKP，结果与培养及qPCR完全一致；人工污染的食品与环境样本中，检测结果同样与参考方法吻合，证实体系在实际场景中的可靠性。

讨论部分指出，现有RPA-CRISPR/Cas12a方法多仅靶向单一病原基因，未覆盖耐药基因，而本研究双靶标单管体系可实现KP与bla_OXA-48型CRKP同步鉴别，兼具闭管防污染与蓝光可视化优势。单管体系灵敏度略低于两步法，可能源于组分间相互抑制；当前体系仅能检测bla_OXA-48型耐药，未来需拓展至其他耐药基因型，并在自然污染的真实样本与更大规模临床队列中进一步验证。可通过优化裂解缓冲液、引入预富集步骤、结合纳米酶比色技术与集成化仪器进一步提升性能。

结论部分明确，本研究整合RPA与CRISPR/Cas12a技术实现了KP与CRKP的同步检测，两步法检测限为10²CFU/mL，单管体系可在1小时内完成检测，操作简便、防污染且支持可视化判读，虽未追求超高灵敏度，但更适配资源有限地区的POCT与食品安全监测需求，为KP快速现场检测提供了实用新方案。