《Infection and Drug Resistance》：Comparison of Xpert MTB/RIF Assay and the Targeted Next-Generation Sequencing for the Diagnosis of Pleural Tuberculosis: A Prospective Comparative Diagnostic Accuracy Study
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目的：鉴于现有检测方法在低菌量疾病中灵敏度有限，本研究旨在评估靶向二代测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)——一种针对198种呼吸道病原体的多重PCR结合杂交捕获测序平台——与Xpert MTB/RIF在各
目的：鉴于现有检测方法在低菌量疾病中灵敏度有限，本研究旨在评估靶向二代测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)——一种针对198种呼吸道病原体的多重PCR结合杂交捕获测序平台——与Xpert MTB/RIF在各类标本中诊断胸膜结核(pleural tuberculosis, TB)的性能差异。患者与方法：前瞻性纳入连续就诊的临床疑似胸膜结核患者。最终诊断采用结合微生物学、组织病理学与临床标准的复合参考标准确立。对配对的痰液、胸腔积液及胸膜活检标本同步行tNGS、Xpert MTB/RIF及分枝杆菌培养检测，并计算灵敏度、特异度等诊断效能指标。预设对105例配对标本进行tNGS与Xpert MTB/RIF的比较，采用Cohen’s kappa评估一致性。结果：在全队列(N=142)中，以复合参考标准为参照，tNGS在各类型标本中的灵敏度均高于Xpert MTB/RIF与分枝杆菌培养，且在非结核组(n=8)中保持100%的特异度。痰标本中，tNGS灵敏度达72.73%，显著优于Xpert MTB/RIF(21.43%)与MTB培养(16.30%)。胸腔积液中，tNGS灵敏度为43.64%，优于Xpert MTB/RIF(30.49%)与MTB培养(24.14%)，与腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)≥40 U/L的效能(46.22%)相当。配对分析证实tNGS的总体诊断检出率显著高于Xpert MTB/RIF(p<0.01)，额外检出26例后者漏诊的阳性病例。在培养阴性胸膜结核患者中，tNGS检出24/60例(40.0%)，而Xpert MTB/RIF仅检出6/60例(10.0%)。结论：tNGS在胸膜结核诊断中，尤其是低菌量与培养阴性病例中，较传统分子及培养方法提供了增量诊断价值。其增加了培养及Xpert阴性病例的病原学确诊率，最适合作为分层诊断框架中的补充二线检测，尽管本研究未评估其对下游临床结局的影响。
胸膜结核是肺外结核的重要类型，近二十年来发病率呈明显上升趋势，占结核病患者的3%至30%，并带来显著的发病与死亡负担。其诊断长期面临核心困境：胸膜腔内的免疫反应导致病变呈典型的低菌量(paucibacillary)特征，使得涂片镜检、传统培养及主流分子检测如Xpert MTB/RIF在胸腔积液中的灵敏度普遍不足，常低于30%，极易造成假阴性。此外，临床表现缺乏特异性，进一步加剧了早期精准诊断的难度。虽然Xpert MTB/RIF革新了结核病诊疗，但在胸膜结核这一特定场景下，其检测下限难以满足低载量样本的需求。在此背景下，靶向二代测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)作为一种新兴技术，通过多重PCR富集与高通量测序的结合，理论上拥有更低的最低检测限(limit of detection, LOD)，能够捕捉片段化或低丰度的分枝杆菌DNA，为解决这一难题提供了新的可能。然而，tNGS在胸膜结核中的确切临床角色此前尚未明确。为此，研究人员开展了一项前瞻性头对头诊断准确性研究，旨在比较tNGS与Xpert MTB/RIF及培养在不同标本类型中的表现，重点评估其在常规检测阴性患者中的增量诊断价值。该研究发表于《Infection and Drug Resistance》。
研究人员在山东公共卫生临床中心开展了这项前瞻性研究。关键技术方法包括：前瞻性纳入2023年1月至2025年9月期间连续就诊的疑似胸膜结核患者，构建包含142例患者的队列。研究采用严格的复合参考标准(composite reference standard)，综合微生物学、组织病理学及临床治疗反应确立最终诊断。对所有入组患者的配对痰液、胸腔积液及胸膜活检标本，同步进行分枝杆菌培养、Xpert MTB/RIF及tNGS检测。统计分析采用配对McNemar检验比较tNGS与Xpert的检测效能差异，并使用Cohen’s kappa评估两种方法的一致性。
研究结果部分，首先展示了患者特征与标本分布。全队列共142例患者，其中细菌学确诊54例，临床诊断80例，非结核8例。两组结核患者在年龄、性别及干扰素-γ释放试验(Interferon-Gamma Release Assays, IGRAs)阳性率上无显著差异，但确诊组的胸腔积液腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)水平中位数显著高于临床诊断组(45 U/L vs 30 U/L)。在诊断效能评估中，tNGS在所有标本类型中均表现出优于传统方法的灵敏度，且在非结核组中保持了100%的特异度。具体而言，痰标本中tNGS灵敏度高达72.73%，远超Xpert MTB/RIF的21.43%；胸腔积液中tNGS灵敏度为43.64%，虽略低于ADA≥40 U/L的46.22%，但显著优于Xpert MTB/RIF的30.49%；胸膜活检标本中tNGS灵敏度最高，达到77.78%。在关键的配对比较分析中，基于105对患者数据，tNGS的总体诊断检出率显著优于Xpert MTB/RIF(p<0.01)，额外检出26例阳性病例，且两种方法的一致性仅为中等(Kappa=0.49)。特别是在最具挑战性的培养阴性亚组中，tNGS成功检出了40.0%的病例，而Xpert MTB/RIF仅检出10.0%。
讨论部分指出，tNGS的核心优势在于提升了低菌量和培养阴性胸膜结核的病原学确诊率，有效减少了诊断不确定性。值得注意的是，tNGS在痰标本中表现出极高的灵敏度，提示其作为无创替代标志物的潜力，但由于配对样本量限制，这一优势在统计学上未完全确立。相比之下，胸腔积液因局部生物学环境限制，tNGS灵敏度有所下降。研究人员强调，tNGS与Xpert MTB/RIF并非相互替代，而是互补关系。鉴于tNGS较长的周转时间(约48小时)和对专业设施的要求，而Xpert MTB/RIF具有快速(约2小时)、自动化的优势，两者应构成分层诊断策略：Xpert MTB/RIF作为一线初筛工具，tNGS则作为二线补充检测，专门用于一线检测阴性但仍高度怀疑胸膜结核的患者。同时，ADA仍作为重要的筛查指标，应与分子检测联合判读。研究人员也客观分析了研究的局限性，包括非结核组样本量小导致特异度估计不稳定、单中心设计及未使用更敏感的Xpert Ultra作为对照等。
结论部分翻译如下：tNGS在胸膜结核诊断中，相较于Xpert MTB/RIF和分枝杆菌培养，展现了增量诊断价值，尤其在配对分析及培养阴性或Xpert阴性患者中表现突出。在匹配比较中，tNGS识别出了Xpert MTB/RIF漏诊的额外病原学确诊病例，支持其在降低低菌量疾病诊断不确定性中的作用。鉴于本研究为单中心设计、非结核组样本量小以及关键配对亚组样本量有限，这些发现应谨慎解读，这些因素限制了统计精确性和结果的普适性。值得注意的是，尽管在痰标本中观察到更高的绝对灵敏度，但配对比较未达到统计学显著性，这很可能反映了统计效力不足而非真实的等效性。总体而言，研究结果支持一种分层诊断策略，即将tNGS定位为补充性二线检测，特别适用于初始分子及培养检测阴性的患者，而非一线诊断的替代品。
