《Frontiers in Veterinary Science》：Leveraging single B cell antibody platforms to develop countermeasures against animal viral diseases: recent advances and future perspectives
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单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）的发现与应用从根本上革新了临床医学，推动了疾病预防、精准诊断及靶向治疗的范式转变。对高亲和力抗体的需求持续增长，然而杂交瘤技术与噬菌体展示等传统发现平台存在效率低、天然配对被破坏及流程耗时等问
单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）的发现与应用从根本上革新了临床医学，推动了疾病预防、精准诊断及靶向治疗的范式转变。对高亲和力抗体的需求持续增长，然而杂交瘤技术与噬菌体展示等传统发现平台存在效率低、天然配对被破坏及流程耗时等问题。单细胞B细胞抗体技术通过直接从抗原特异性B细胞中调取天然配对的重链与轻链序列，克服了上述局限，保留了真实的亲和力与特异性。继该平台在应对新型冠状病毒病（COVID-19）等人类突发公共卫生事件中取得显著成功后，正被迅速应用于兽医病毒病领域，这是“全健康（One Health）”框架下保障动物与公共卫生安全的重要举措。本综述系统阐述了基于单细胞B细胞的单抗发现的核心原理与工作流程，总结了该技术近期在动物感染病毒及人兽共患病毒中的应用进展，重点说明如何利用天然抗体库获得高亲和力单抗。最后，文章讨论了当前面临的技术挑战，提出了提升兽医免疫治疗可及性与疗效的未来研究方向。
1 引言
传染病仍是全球健康的持续性重大威胁，对人与动物种群均产生显著影响。其中，病毒感染因其高致病性、基因组快速突变及免疫抑制能力尤为棘手，在登革病毒（DENV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和寨卡病毒（ZIKV）等全球暴发中占据新发传染病的重要比例。在兽医领域，非洲猪瘟病毒（ASFV）与口蹄疫病毒（FMDV）等跨境疫病给畜牧业造成灾难性经济损失，犬瘟热病毒（CDV）等持续威胁伴侣动物安全。因此，开发精准诊断工具与有效治疗干预措施已成为兽医学的紧迫任务。在此背景下，单克隆抗体凭借高特异性、起效快及病毒中和能力成为重要的生物制品，蛋白质工程的发展进一步拓展了其应用范围，包括优化药代动力学特征、增强效应功能及双特异性设计。传统单抗制备长期受限于技术瓶颈：杂交瘤技术融合效率低，噬菌体展示存在人工轻重链配对及天然亲和力丢失问题。单细胞B细胞抗体技术通过荧光激活细胞分选（FACS）与微流控技术直接解析天然免疫组库，可在数周内完成过去需数月的工作流程，捕获稀有超强效克隆，突破了传统方法的效率限制。兽医学单抗研发虽借鉴人类生物医学进展，但在基因组注释与生产成本方面面临独特挑战。本综述旨在阐明针对动物病毒病原的单细胞B细胞单抗发现原理与流程，总结该平台在主要兽医物种中的应用，并探讨其在兽医科学实施中的技术障碍与发展方向，推动从学术创新到临床应用的转化。
2 单抗分离技术平台：从杂交瘤到单细胞B细胞技术
2.1 小鼠杂交瘤技术
由Milstein和K?hler开创的杂交瘤技术依赖将抗原致敏B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，生成分泌单抗的杂交瘤。在兽医领域，该技术被广泛用于制备猪流行性腹泻病毒（PEDV）、ASFV及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等猪病原的单抗，支撑酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）及免疫组织化学（IHC）等多种诊断平台，并与胶体金结合用于伴侣动物感染的快速检测试纸。尽管应用广泛，杂交瘤技术存在劳动强度大、耗时长及融合效率低等固有缺陷，且杂交瘤克隆遗传不稳定，不利于长期冻存与复苏。从治疗角度看，鼠源单抗因半衰期短及潜在免疫原性反应限制了在其他物种的临床应用。这些局限性促使替代性高效生产平台的开发。
2.2 噬菌体展示技术
噬菌体展示技术通过将抗体片段编码基因与噬菌体衣壳蛋白融合，经生物淘选实现高通量筛选，可筛选1010至1012规模的文库，已成功开发阿达木单抗、阿特珠单抗等获批人用治疗药物。在兽医科学中，该技术正被用于牛、家禽、绵羊及猪的诊断与治疗性抗体片段开发。尽管应用灵活，其关键局限在于免疫球蛋白及其片段在原核宿主中表面表达不稳定，常导致低表达水平或错误折叠，使得全长IgG展示困难。此外，筛选过程中的扩增偏倚会导致快速复制的噬菌体克隆胜过生长较慢但结合亲和力更高的克隆，这种生物学偏倚可能导致高亲和力结合剂丢失，同时富集生长特性强的克隆，限制了所获抗体库的功能多样性与质量，需持续优化。
2.3 单细胞B细胞抗体技术
该技术已成为单抗发现领域的变革性策略，重新定义了高亲和力治疗药物产生的速度与精度。不同于依赖低效细胞融合的杂交瘤技术或人工组合配对轻重链的噬菌体展示平台，该方法可直接从单个抗原特异性B淋巴细胞中获取天然抗体序列。其操作流程整合了以FACS与微流控为核心的高通量细胞分选技术，根据特定表面标志物或抗原结合特征分离单个B细胞，随后通过单细胞逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增VH与VL区可变区，并克隆至表达载体进行重组生产。其核心优势在于保留天然VH-VL配对，确保所得抗体维持体内成熟的天然亲和力、特异性和体细胞高频突变谱。此外，该技术规避了细胞永生化相关的长时间筛选周期，避免了展示技术的文库偏倚，将发现周期从数月压缩至数周，特别有利于捕获在杂交瘤低效融合或细菌培养竞争中丢失的稀有超强效克隆。鉴于其可快速采样整个免疫组库，单细胞B细胞克隆已成为开发针对新发传染病威胁与复杂病理靶点的中和抗体的首选平台。
3 单细胞B细胞抗体发现流程
3.1 动物免疫与B细胞富集
B淋巴细胞通常采集自动物免疫组库，小型动物如小鼠因外周血量有限，主要采用脾脏或淋巴结作为来源，经机械匀浆后通过密度梯度离心富集B细胞。人类及大型动物则可重复微创采集外周血单个核细胞（PBMCs）以分离抗原特异性B细胞。为提高分离效率，动物通常接受多剂量免疫以增强体液免疫反应，并常采用异源初免-加强策略诱导广谱中和抗体。在人类队列中，受伦理与安全规范限制，PBMCs一般来自接种疫苗的志愿者或康复患者以捕获自然获得的免疫力。分选前需通过ELISA与病毒中和试验定量血清抗体滴度，仅选择血清滴度高的个体进行下游B细胞分离。
3.2 单细胞B细胞的鉴定与分离
B细胞区室包含不同发育亚群，类别转换记忆B细胞与抗体分泌细胞（ASCs，尤其是浆母细胞与浆细胞）因表达经过体细胞高频突变、亲和力成熟的B细胞受体（BCRs），是发现高亲和力抗体的首选靶点。多参数FACS是常规分离方法，利用荧光标记的抗谱系与表面标志物（如IgG、IgM、CD20、CD19）区分B细胞群体，并使用保留病原体天然构象表位的标记“诱饵”抗原确保特异性。例如在SARS-CoV-2治疗中，刺突（S）蛋白受体结合域（RBD）常被用作分子探针捕获强效中和克隆。常规流程中，FACS利用双标记策略（抗原阳性与谱系阳性）将单个细胞分配至独立孔中，实现抗原特异性细胞的精准正选并排除非特异性结合者。
3.3 Ig基因扩增与克隆
分离后的单个B细胞直接加入含裂解缓冲液的96孔板以释放细胞内RNA。由于单细胞中RNA量极少，96孔板格式优化了向RT-PCR与巢式PCR的衔接，最小化样品损失与交叉污染风险。巢式PCR以单细胞cDNA为模板进行第一轮扩增，产物作为第二轮模板，使用特异性引物扩增轻重链可变区基因。引物通常依据IMGT数据库设计，正向引物位于可变区信号肽区域，反向引物位于CH1或CL区等核苷酸序列相对保守的区域。近年来，基于二代测序（NGS）的平台如通过测序关联B细胞受体与抗原特异性（LIBRA-seq）在高通量获取配对轻重链序列方面日益重要。LIBRA-seq通过将抗体序列数据与抗原特异性物理耦合，可同时对单个B细胞组库针对多种不同抗原靶点的筛查，突破荧光分选固有的光谱重叠限制，已成功用于识别HIV与流感病毒等的广谱抗体。然而，该技术目前在兽医中应用有限，主要受限于平台的技术复杂性与高昂成本。
3.4 抗体反应性及功能性评价
重组抗体生产依赖多种表达平台，包括原核、植物与哺乳动物系统。大肠杆菌等原核宿主虽可表达Fab段抗体基因，但缺乏必需的翻译后修饰与复杂蛋白折叠机制。植物系统成本低廉，但大规模纯化与监管安全性问题限制了广泛应用。因此，哺乳动物细胞系统仍是行业标准，能确保全长免疫球蛋白的正确折叠、组装与分泌，其中中国仓鼠卵巢（CHO）细胞与人胚肾（HEK293）细胞最为常用，约70%的上市治疗性抗体由CHO细胞系统生产。表达后通常通过亲和层析纯化抗体，并利用Western Blot（WB）、ELISA、IFA及病毒中和试验表征其生物学活性。
传统发现流程需对每一个识别的序列单独克隆、表达与纯化以确定特异性，这种“序列优先”策略劳动密集且效率低。为突破这一瓶颈，研究人员开发了稳定表达CD40配体（CD40L）、白细胞介素-2（IL-2）与IL-21的饲养细胞系统，支持单个抗原特异性B细胞的共培养，促进其在体外持续增殖与抗体分泌。该“先筛选”策略的关键优势在于仅对证实具有抗原反应性的培养孔中的免疫球蛋白基因进行选择性扩增与克隆，从而简化下游表征。结合高通量与自动化培养及筛选步骤的技术平台已逐步发展，如Beacon光流控系统已在呼吸道合胞病毒（RSV）与HIV-1等人类病毒病原的中和抗体高效筛选中验证有效，并在兽医应用中显示出潜力。近期研究报道利用IL-2与IL-21共刺激成功扩增犬B细胞，实现了针对犬细小病毒（CPV）的单克隆抗体的精准鉴定，为新型兽药开发奠定了技术基础。
4 单细胞B细胞抗体技术在畜禽病毒病中的应用
4.1 猪
4.1.1 经典猪瘟病毒（CSFV）
利用单细胞B细胞分离技术，研究人员从接种含C株E2蛋白的KNB-E2亚单位疫苗的猪中鉴定出3个靶向CSFV的猪源中和单抗（mAb1、mAb9、mAb11），在125 μg/mL浓度下对CSFV Alfort株可完全保护ST细胞。另有研究从E2免疫小鼠脾细胞分离到3A9与4F7单抗，分别结合线性B细胞表位25GLTTTWKEYSHDLQL39与259GNTTVKVHASDERGP273。为提升发现精度，研究人员采用荧光标记的线性中和表位结合抗猪IgG的流式策略，从预筛高CSFV抗体滴度的猪中获得了HK24与HK44两个单抗，识别E2蛋白上的保守线性表位，具有高诊断特异性与强中和活性。
4.1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）
针对PRRSV非结构蛋白nsp12抗原特性不明的问题，研究人员利用真核表达的nsp12免疫小鼠，通过FACS分离到mAb 1N14与mAb 2S18两个单抗，利用mAb 1N14鉴定出新颖线性表位104YEFTGNGEDW113，并通过细胞共聚焦分析显示nsp12在感染早期呈点状分布于细胞质并聚集于核周区。另有研究通过反向疫苗学方法，从先后接种改良活PRRSV-2疫苗与不同野外毒株的猪中分离记忆B细胞并进行永生化，鉴定出5个PRRSV特异性B细胞群，其中4个靶向主要囊膜糖蛋白GP5，BNW7p5c4克隆上清具有针对PRRSV-2 ATP株的中和活性。
4.1.3 猪流行性腹泻病毒（PEDV）
研究人员利用完整PEDV病毒粒子、核衣壳（N）蛋白及截短刺突（S）蛋白作为诱饵，从免疫猪中分离到20个PEDV特异性单抗，其中3个N蛋白特异性克隆识别保守线性表位，适用于广谱诊断试剂开发。另有研究以真核表达纯化的PEDV S1蛋白为筛选诱饵，分离到高亲和力全猪源单抗C62，体内评估显示其可显著延缓攻毒仔猪临床症状发生并降低死亡率。
4.1.4 非洲猪瘟病毒（ASFV）
研究人员以重组CD2v蛋白为免疫原，利用单细胞B细胞技术成功克隆表达并获得14个鼠源单抗，间接ELISA均呈反应性，其中8个在ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞（PAM）中经IFA特异性识别CD2v。研究利用特异性单抗C89建立了阻断ELISA方法，具有高特异性、灵敏度与重复性，为ASFV快速临床检测与流行病学监测提供了优质试剂。
4.1.5 塞内卡病毒A（SVA）
研究人员应用单细胞B细胞分选技术直接从自然宿主猪中分离抗体，通过单细胞分选与RT-PCR获得B细胞免疫球蛋白轻重链可变区基因，生产出1M5与1M25两个全猪源单抗，并据此建立竞争性ELISA（NAC-ELISA）用于中和抗体检测，灵敏度达98.11%，特异性为100%，与病毒中和试验高度一致且无其他病毒感染血清的交叉反应。
4.2 牛
4.2.1 口蹄疫病毒（FMDV）
牛的体液免疫系统具有独特的抗体结构，其互补决定区H3（CDR H3）平均长度达26个氨基酸，轻链使用存在显著偏倚，Igλ约占表达库的95%。研究人员利用单细胞B细胞技术从FMDV O型感染牛中分离到13个中和单抗，统计分析显示具有延长CDR H3区域的抗体表现出更优中和效力，表明长CDR H3环可通过穿透FMDV衣壳上的糖基屏蔽或深埋受体结合位点发挥关键作用。
4.2.2 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）
牛的超长CDR H3抗体平均可达61–62个氨基酸，形成“茎上结”基序并由多样二硫键稳定。研究人员采用流式分选结合低通量半巢式PCR与Sanger测序、中通量索引PCR与NGS、高通量10x Chromium Next GEM处理等策略捕获序列，从BVDV免疫牛淋巴细胞中分离到超长CDR H3抗体H12克隆，表现出强效剂量依赖性病毒结合能力。
5 伴侣动物病毒病管理的先进抗体发现
5.1 犬
5.1.1 犬瘟热病毒（CDV）
研究人员利用单细胞B细胞分选挖掘天然犬免疫组库，通过FACS分离单个B细胞并扩增天然轻重链基因，获得全犬源单抗，确保了天然宿主配对与生物相容性，其中靶向CDV血凝素（H）蛋白的高亲和力候选单抗D16在体内治疗试验中可有效抵抗致死性攻毒，显著提高生存率，降低全身病毒载量并减轻间质性肺炎等严重肺部病变。
5.1.2 犬细小病毒（CPV）
研究人员利用FACS从外周血中分离IgM?/IgG+B细胞，通过巢式PCR扩增可变区基因并在HEK293细胞中表达，获得60个单抗，其中5个具有强中和活性。另有研究优化流程，结合荧光病毒样颗粒（VLPs）流式分选与B细胞培养步骤，在基因扩增前先筛选培养上清的免疫球蛋白结合活性，有效过滤低亲和力结合剂，减少非中和抗体纯化带来的时间与经济负担。
5.2 马
5.2.1 马流感病毒（EIV）
研究人员建立以EIV血凝素（HA）蛋白为抗原模型的平台，从马BCR组库中分离针对不同EIV毒株的中和单抗，其中H81克隆在体外表现出优异的广谱交叉中和活性，可有效保护攻毒小鼠，显著改善生存率、减轻肺部炎症并降低病毒滴度。结构分析在HA蛋白中鉴定出包含27个关键氨基酸的保守功能区，其中12个残基与H81具有高预测结合亲和力，且该预测表位与已知马HA受体结合位点重叠，解释了其广谱中和能力的机制。
6 靶向人兽共患病原的动物免疫组库
6.1 尼帕病毒（NiV）
研究人员通过多色FACS高通量单细胞B细胞筛选，从免疫小鼠免疫组库中直接快速分离到5个靶向NiV糖蛋白（G）的高亲和力单抗，构建了新型扩增发光邻近均质分析（AlphaLISA）诊断平台，灵敏度较传统ELISA提高约41.7倍，操作时间缩短至30分钟以内，且对寨卡病毒与日本脑炎病毒等其他病原保持高特异性。
6.2 人类免疫缺陷病毒（HIV）
研究人员优化流式策略，从猕猴中分离单个HIV-1包膜特异性B细胞，实现高亲和力猕猴单抗的精准克隆。同时利用牛超长第三重链互补决定区（HCDR3）的独特结构，通过单细胞分离获得HCDR3长达60个氨基酸的单抗，可穿透病毒包膜隐蔽表位，中和72%的跨分支分离株，展示了从家畜独特抗体组库中挖掘复杂传染病治疗药物的潜力。
6.3 猴痘病毒（MPXV）
研究人员结合mRNA免疫与高通量单细胞B细胞测序，以MPXV A29L表面蛋白为靶点获得高亲和力单抗，并利用M53与M78抗体开发出超灵敏荧光免疫层析试验（SiTQD-ICA），20分钟内最低检测限达5 pg/mL，对水痘与多种呼吸道病原保持高特异性，可在皮疹出现前的咽拭子中检测到病毒抗原，助力潜伏期内隐性传播的监测。
6.4 裂谷热病毒（RVFV）
研究人员整合流式分选与基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq），从免疫小鼠记忆B细胞中快速筛选并重组表达了23个候选单抗，其中约半数表现出对其同源抗原的高亲和力特异性结合，验证了单细胞B细胞转录组学作为针对复杂人兽共患病毒靶点加速抗体发现的稳健高通量引擎的作用。
7 单细胞B细胞抗体技术在兽医学中的前景
单细胞B细胞抗体发现平台正逐步取代传统方法，推动兽医免疫学的转型。其主要优势在于快速高效地分离先导抗体候选物，通过荧光标记抗原精准分离高亲和力记忆B细胞或浆母细胞，无需细胞永生化，将免疫至序列鉴定的周期压缩至1–2周，对突发人兽共患或动物流行病应对至关重要。该技术还保留了天然轻重链配对，避免了传统平台的免疫多样性丢失问题，可获取包括稀有高亲和力克隆在内的完整免疫组库。兽医物种独特的免疫学结构与遗传特征可通过单细胞测序加以利用，例如牛的超长CDR H3环可穿透病毒抗原的隐蔽表位，兔的单B细胞抗体因基因转换机制通常具有更高亲和力与特异性。商业层面，犬源抗IL-31单抗Lokivetmab的成功验证了物种匹配策略的市场可行性，单细胞B细胞技术为下一代物种特异性治疗性抗体提供了高效路径，尤其在兽医肿瘤学中，快速分离犬源抗PD-1抗体有望革新伴侣动物癌症治疗。
8 单细胞B细胞抗体技术在兽医学中的挑战
从传统杂交瘤技术向单细胞B细胞平台的转型面临独特生物学、技术与经济障碍。许多兽医物种免疫球蛋白（Ig）基因座缺乏全面注释，种系V(D)J组库不完整，迫使研究人员使用简并引物，降低了灵敏度并引入偏倚，可能导致高亲和力克隆丢失。FACS分选依赖的特异性表面标志物（如CD19、CD20、CD38）在兽医物种中缺乏经验证商用试剂，常需借用交叉反应的人或小鼠抗体，易产生低亲和力或非特异性结合，需耗费时间验证每个新物种的标志物。成功分离的抗体在临床转化时常受免疫原性限制，异源抗体可能引发抗药物抗体（ADAs）反应，需进行类似人源化的物种适配工程，而框架区结构的完整性对维持CDR环天然构型与抗原结合亲和力至关重要，改变可能导致亲和力下降。经济层面，兽医学与人的制药工业框架不同，兽药尤其是 livestock 产品需保持成本效益，单细胞测序、微流控平台及高通量重组表达的高资本投入仍是兽医实验室的主要进入壁垒。从实验室克隆到规模化生产还需严格质量控制，兽药常需在冷链条件不佳的环境下运输，制剂稳定性开发进一步增加了研发周期与成本，监管路径仍需大量安全性数据与田间试验支持。
9 结论
单细胞B细胞抗体技术是兽医医学的前沿方向，能够快速生成针对病毒病原与慢性疾病的高亲和力天然配对抗体，并挖掘牛、猪等物种独特免疫组库以拓展抗原识别的结构解决方案。然而，充分发挥其潜力需克服基因组注释不足、试剂匮乏与生产成本高等障碍。未来研究应优先扩展兽医物种的公共Ig种系数据库，并开发低成本高效筛选平台，推动从学术发现到临床应用的转化。
