《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Antibody display technologies from phages to cells: translational bottlenecks and AI-enabled opportunities
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自1975年开创性的杂交瘤技术问世以来，抗体生成方法已取得实质性进展，最终发展为当今的单细胞技术。每一种连续的方法都贡献了独特的应用、优势与不足，反映了该领域的动态发展进程。研究人员强调了将单细胞RNA测序(scRNA-seq)与展示技术整合的影响，这通过实现
自1975年开创性的杂交瘤技术问世以来，抗体生成方法已取得实质性进展，最终发展为当今的单细胞技术。每一种连续的方法都贡献了独特的应用、优势与不足，反映了该领域的动态发展进程。研究人员强调了将单细胞RNA测序(scRNA-seq)与展示技术整合的影响，这通过实现诊断和治疗方法性抗体的高效鉴定与开发，为医疗健康行业带来了潜力。文中讨论了通过各项主要技术生产的单克隆抗体(MAbs)，以说明实际成果。研究人员还探讨了糖基化在维持抗体稳定性与功能方面的关键作用。此外，研究人员论述了单细胞RNA测序(scRNA-seq)可实现免疫组库与肿瘤异质性的高分辨率分析，促进抗原特异性抗体及稀有细胞群的鉴定。与微流控技术及计算分析的整合可增强生物标志物发现与细胞特异性分辨率，这些进展支持个性化治疗并加速下一代抗体发现。最后，研究人员阐述了机器学习与人工智能在抗体发现中新兴的整合应用，重点强调表位映射及从一级氨基酸序列预测三维蛋白质结构的最新进展。总体而言，这些发展有望彻底变革抗体工程，并扩大其对治疗创新的影响。
1 引言
抗体是具有卓越靶标选择性的高特异性识别分子，其结构与多样性使其能够以高特异性和亲和力结合多种抗原，是现代生物技术的重要工具。截至2026年，自利用杂交瘤技术发现单克隆抗体(MAbs)已过去50余年，这类抗体已成为疾病诊断的关键工具。图1展示了迄今为止各类展示技术的重大里程碑与进展，近年来FDA批准了大量治疗性抗体，单克隆抗体管线呈持续增长趋势，晚期临床试验中的抗体药物数量增至178个，较此前的138个实现了显著增长。抗体发现阶段是开发裸单价抗体、抗体偶联药物(ADCs)、双特异性/多特异性抗体、免疫偶联物、抗体混合物及放射免疫治疗用抗体等各类高级抗体形式的基础。单克隆抗体已在定制化靶向治疗中引发革命，代表了精准医疗的前景，是目前增长最快的治疗分子类别之一。展示技术是开发人用靶标特异性抗体的高效生物技术工具，可使研究人员从大型文库中筛选治疗性抗体，尤其适用于针对免疫原性弱或难靶向的靶点，广泛应用于感染性疾病、自身免疫病及过敏性疾病等多个治疗领域。相较于杂交瘤技术来源的抗体，不同展示技术开发的抗体具有更优的结合亲和力与特异性。图1按时间线概述了抗体发现技术的演变历程，具体将在下文详细讨论。与以往聚焦单一抗体展示平台的综述不同，本综述通过整合抗体发现的多个维度，提供了比较性与转化视角，将经典展示技术与单细胞RNA测序、人工智能驱动设计等新兴方法相结合，并在表1中总结了当前局限与瓶颈，为下一代抗体发现提供了更具批判性与应用导向的框架。
2 抗体发现技术
2.1 杂交瘤技术
1975年Georges Kohler与Cesar Milstein开发的杂交瘤技术实现了抗体产生细胞的永生化，可制备高度抗原特异性的单克隆抗体，无需像传统多克隆血清抗体那样依赖动物维持生产。该技术通过将抗原特异性B细胞与永生骨髓瘤细胞融合实现：首先将特定抗原免疫小鼠，数周后B细胞分化激活记忆B细胞与浆B细胞，通过ELISA检测血清中抗原特异性抗体水平、流式细胞术分析B细胞群评估免疫反应后，取脾脏、骨髓或外周血单个核细胞(PBMCs)分离活化B细胞，利用聚乙二醇(PEG)或电融合将B细胞与骨髓瘤细胞融合。融合选用对HAT（次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷）敏感的HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺陷型骨髓瘤细胞，PEG介导细胞膜融合形成异核体，随后在HAT培养基中筛选：氨基蝶呤阻断核苷酸合成通路，次黄嘌呤与胸苷供HGPRT阳性细胞存活，有限寿命的未融合B细胞与HGPRT缺陷的未融合骨髓瘤细胞均死亡，存活的即为杂交瘤细胞。通过有限稀释法将单个杂交瘤细胞接种至96孔板，可筛选获得编码特定表位抗体的杂交瘤细胞，进而通过体内或体外培养生产单克隆抗体。首个获FDA批准用于治疗的人用单克隆抗体是1986年获批的鼠源抗体muromonab；1997年获批的利妥昔单抗是首个用于人体的嵌合完整抗体，靶向CD20细胞，通过多种机制治疗非霍奇金淋巴瘤，其鼠源可变区负责特异性识别，人源Fc恒定区可有效介导补体与细胞毒性作用；2003年获批的托西莫单抗是与碘-131偶联的抗CD20抗体，可诱导结合B细胞凋亡。
2.2 展示技术
2.2.1 噬菌体展示
噬菌体展示由Smith于1985年发现，利用基因工程将外源DNA片段插入丝状噬菌体的基因III，使插入序列编码的融合蛋白组装至感染性病毒颗粒表面，实现外源肽的噬菌体表面展示，John McCafferty团队首次证实噬菌体抗体展示的可行性。抗体文库分为天然文库、半合成文库与全合成文库：天然文库源自免疫或初始B细胞，反映体内免疫组库；半合成文库将天然抗体框架与人工多样化的互补决定区(CDRs)结合，在保证结构稳定的同时提升多样性；全合成文库则完全采用设计序列，可精准调控多样性与生物物理特性。通常将抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过连接子融合为单链可变片段(scFv)，克隆至载体并与次要衣壳蛋白PIII或主要衣壳蛋白PVIII融合。常用f1、fd、M13噬菌体转染大肠杆菌构建文库，其中M13丝状噬菌体是最常用的抗体展示系统，可将scFv等抗体片段与pIII衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面，通过抗M13 HRP偶联抗体检测结合抗原的噬菌体。T7噬菌体因对失活的抗性更强可作为M13的替代系统，可更高拷贝数展示小于50个残基的小肽；λ噬菌体则适用于表达高分子量蛋白，无需细菌转化即可引发更强免疫反应。2002年获FDA批准的首个噬菌体展示来源治疗性抗体阿达木单抗，靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)，通过阻断TNF-α与其细胞表面受体TNFR1、TNFR2的结合抑制炎症信号通路，用于治疗类风湿关节炎、银屑病关节炎等疾病，该技术也已成功用于从活动性黏膜类天疱疮患者中分离人单克隆抗桥粒芯糖蛋白自身抗体。
2.2.2 细菌展示
细菌展示技术是噬菌体展示的替代方案，革兰氏阴性大肠杆菌因生长快、遗传背景清晰、操作简便、生产成本低成为最常用的宿主，其 expansive的细胞表面可通过荧光技术与流式细胞术对展示文库进行分选筛选。研究显示利用嗜冷杆菌AT877自转运蛋白优化10Fn3支架蛋白的展示，构建组合文库筛选出亲和力显著提升的TNF结合蛋白。革兰氏阴性菌展示需选择合适的锚定基序以维持细胞包膜稳定性，但蛋白需穿过两层细胞膜，难以展示大分子量蛋白；革兰氏阳性菌无外膜且肽聚糖细胞壁厚，单层细胞膜更利于锚定融合蛋白的转运，葡萄球菌属如肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌均可用于表面蛋白展示。
2.2.3 酵母展示
酵母展示技术于1997年开发，采用真核宿主显著提升哺乳动物蛋白表达效率，常用酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多态汉逊酵母作为宿主。目标蛋白通常位于血凝素标签(HA)与c-Myc标签之间，与Aga2P亚基锚定蛋白融合，翻译后Aga2P亚基通过二硫键与725个氨基酸的凝集素Aga1P亚基连接，Aga1P共价锚定于细胞壁，最终将目标蛋白展示于酵母表面。展示蛋白可通过荧光激活细胞分选(FACS)与磁激活细胞分选(MACS)筛选，核心优势是具备功能完善的翻译后修饰系统，可合成多二硫键，相较于其他真核展示系统耗时更短、技术要求更低；局限性在于酵母糖基化过程与哺乳动物细胞存在差异，且文库规模上限为109个变体，低于噬菌体展示的1011个变体。2020年Lundbeck Seattle Biopharmaceuticals利用毕赤酵母作为宿主开发的依普奈珠单抗，通过阻断降钙素基因相关肽(CGRP)传导疼痛信号治疗成人偏头痛；另有研究通过竞争性酵母展示文库分选，从初始抗体库中快速分离出靶向登革病毒野生型包膜蛋白结构域III的中和抗体。
2.2.4 核糖体展示
核糖体展示是一种无细胞的体外蛋白生产技术，新生mRNA与蛋白结合于核糖体，通过形成稳定的蛋白-核糖体-mRNA复合物(PRM)实现表型与基因型（对应mRNA）的偶联，可在大肠杆菌S30或兔网织红细胞裂解物等无细胞系统中整合体外扩增与随机突变。兔网织红细胞系统含二硫苏糖醇(DTT)，可能影响二硫键形成从而降低折叠稳定性，不同抗体的功能受影响程度存在差异，2–5 mM DTT也常用于兔网织红细胞裂解物系统中的变性蛋白重折叠。
2.2.5 哺乳动物细胞展示
哺乳动物细胞展示平台旨在提升scFv片段的亲和力成熟，通常在人胚肾293T(HEK-293T)细胞与中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表面展示，利用pcDNA系列、pDGB载体或病毒载体将重组DNA序列与哺乳动物细胞受体的跨膜(TM)序列融合，使过表达的重组外源蛋白稳定锚定于细胞表面，常用血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜域与G蛋白偶联受体(GPCR)跨膜域辅助表达。核心优势是可在生理相关环境中表达蛋白，实现正确折叠与天然样翻译后修饰，包括N-连接与O-连接糖基化，蛋白质量优于酵母与噬菌体展示系统；主要局限性是成本高、耗时长、劳动强度大。阿替利珠单抗靶向PD-L1受体，获FDA批准用于治疗非小细胞肺癌、尿路上皮癌等多种癌症，最初从噬菌体展示抗体文库中分离，经基因工程改造后在CHO细胞中表达；其与贝伐珠单抗联用治疗不可切除或转移性肝细胞癌的疗效优于索拉非尼等小分子药物。
3 各展示技术面临的转化瓶颈
杂交瘤技术的首要挑战是外周血中抗原特异性B细胞频率极低，仅约万分之一的B细胞具有靶标特异性，导致文库构建难度大；其次细胞融合过程本身对细胞存在应激，PEG等化学试剂可能诱导多核细胞形成，影响杂交瘤的稳定性与功能。噬菌体展示的天然文库需要极大规模，实际文库容量限制可能降低靶标筛选效率，scFv的表达水平不均一也会影响筛选效果；免疫动物来源文库则因免疫流程耗时长限制治疗性抗体开发速度，且对于有毒或非免疫原性抗原无法完成文库构建。酵母展示的文库多样性受PCR扩增偏好性限制，且表面展示用的融合或锚定蛋白的选择会影响蛋白折叠、稳定性与功能活性。核糖体展示虽可构建比细胞系统更大的文库，但缺乏细胞内蛋白折叠 machinery，易形成无功能的错误折叠蛋白，且mRNA-核糖体-蛋白复合物的稳定性受温度、离子强度、pH与组分浓度影响较大，不稳定复合物会导致正确折叠蛋白丢失。细菌展示在文库扩增过程中，部分转化细胞生长更快会引发克隆优势，降低整体文库多样性，减少可选抗体种类；且细菌培养需在37°C最优生长温度下严格无菌操作，不当处理易导致污染，影响培养稳定性与抗体产量。哺乳动物细胞展示的核心挑战是难以构建大规模文库并筛选针对膜蛋白的天然构象抗体，膜蛋白因结构复杂或细胞外环境不稳定难以作为靶点，限制了可筛选抗体的类型；理论文库多样性可达约8×108个变体，但受转导效率、表达水平与克隆代表性限制，有效多样性常降至约6×108个变体，且纯化抗原需以可溶性或固定于微球的形式递呈，进一步限制了靶标类型。
4 糖基化在维持抗体功能与稳定性中的作用
在所有翻译后修饰(PTMs)中，糖基化对抗体结构、功能与稳定性的影响最为显著。IgG类抗体通过抗原结合位点结合靶标后，Fc区域与效应细胞表面的Fcγ受体(FcγR)相互作用，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；也可通过结合C1q蛋白触发补体级联反应，形成膜攻击复合物(MAC)介导补体依赖的细胞毒性(CDC)。糖基化显著影响Fc区域与FcγR的相互作用，部分糖型可增强或抑制该相互作用，调控抗体刺激免疫效应细胞产生的能力：FcγRIIIa的Asn-162位N-连接糖对Fc识别至关重要，去除IgG Fc聚糖的核心岩藻糖可缓解与该受体相关碳水化合物的空间位阻，增强自然杀伤(NK)细胞介导的ADCC，在NK细胞体系中可使ADCC活性提升2–40倍，但该效应并非普遍存在，高度依赖招募的效应细胞类型。研究显示IgG4抗体的ADCC活性随岩藻糖缺失程度线性升高，仅当岩藻糖缺失率高于约20%时可检测到活性，100%缺失时达到最大活性。糖基化还可保护抗体免受蛋白酶降解，提升热稳定性，改变抗体的流体动力学半径以增强溶解度，稳定Fc区域以维持其与效应细胞结合的正确构象。
5 测序赋能的抗体发现新兴技术
除展示技术外，单细胞RNA测序(scRNA-seq)作为横向测量与 profiling技术，可实现抗体基因配对鉴定、免疫组库分析与疾病异质性解析。该技术始于2009年Tang等首次报道单细胞全转录组分析，目前已广泛应用于细胞多组学与空间转录组学，结合人类细胞图谱、小鼠细胞图谱等项目数据，借助人工智能与生物信息算法实现细胞-细胞互作、细胞类型注释与发育推断。单细胞测序首先通过FACS、显微操作、激光捕获显微切割(LCM)、ICELL8系统或Fluidigm C1微流控平台分离单个细胞，随后扩增基因组DNA并纯化，评估浓度、大小与均一性后构建测序文库，采用下一代测序(NGS)分析，DNA测序可选用简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、多重置换扩增(MDA)、多次退火环状循环扩增(MALBAC)等方法，RNA测序可采用SMART-seq、SMART-seq2、CEL-seq等技术，配套Cutadapt、FastQC、BWA等计算工具分析数据。scRNA-seq在癌症研究中发挥关键作用，可检测肿瘤内稀有细胞群与肿瘤微环境，鉴定特异性生物标志物，通过解析基因表达谱、基因突变、免疫检查点、抗原表型与细胞状态实现患者分层，支撑个性化治疗策略开发。研究已证明可利用scRNA-seq结合随机森林(RF)、卷积神经网络(CNN)等机器学习算法筛选肿瘤细胞高表达的基因作为CAR-T靶点；也可通过B细胞受体-抗原关联测序(LIBRA)技术，用DNA条形码抗原混合供者B细胞，同步回收测序结合抗原的B细胞及其BCR，高通量鉴定患者抗原特异性抗体；还可利用抗原表达噬菌体通过FACS分选免疫球蛋白表达细胞，无需单独表达纯化抗体即可富集抗原特异性抗体，大幅缩短开发周期。此外，DNA编码文库(DELs)由共价连接DNA标签的合成小分子化学型组成，每个DNA标签编码对应小分子结构，可实现同步合成与筛选，无需传统高通通量筛选(HTS)的繁琐流程，成本更低且可及性强，目前已发展出针对细胞裂解液中内源性蛋白的非固定化靶点筛选方法，筛选后通过读取DNA标签即可快速鉴定高亲和力结合物。
6 人工智能整合对药物发现与抗体开发的革新
传统抗体开发流程繁琐耗时，小鼠免疫获得的抗体还需进一步人源化以避免不良反应，展示技术也需要大量湿实验操作，且抗体聚集与非特异性结合仍是核心挑战。研究人员已开发结合AI与机器学习的计算工具用于抗体文库从头设计，可精准靶向特定表位，提升抗原-抗体相互作用的整体效能。抗体开发整合机器学习工具可用于优化人源化、预测表位结合、生成序列文库及预测抗原-抗体相互作用。Rosetta算法是公认最成功的蛋白质从头结构预测方法之一，采用基于蒙特卡洛的策略将已知蛋白质结构的短片段组装为天然样构象，抗体理性设计需深入理解包含6个互补决定区(CDRs)超变环的可变区结构。DeepAb工具分为两个阶段：第一阶段网络基于输入的轻重链序列预测可变区(Fv)结构，第二阶段利用基于Rosetta的方法从网络输出预测结构。Google DeepMind开发的AlphaFold(AF)及其AF3版本是用于蛋白质三维结构预测、建模与计算蛋白设计的机器学习算法。尽管计算蛋白建模前景广阔，但在抗体发现中的应用仍具挑战：模拟计算量大，且难以捕捉蛋白质相互作用的上下文依赖性；进化与深度学习虽提升了结构预测准确性，但在缺乏近缘模板时精度仍有限，需持续实验验证。图5展示了AI辅助的理性抗体设计与优化流程：首先通过结构建模、抗原-抗体复合物预测、基于蛋白语言模型的序列生成进行计算机模拟文库预优化，在最大化功能多样性的同时缩小文库规模；随后通过展示筛选、结合实验、中和或效应功能等功能读数，在高通量筛选(HTS)平台表达并检测计算优先的文库；最后将HTS产生的数据输入机器学习模型，实现多维功能分析、亲和力、特异性、可开发性与效应功能预测，以及序列空间的迭代优化。
7 结论与未来展望
抗体展示技术已彻底变革治疗性抗体的发现、优化与工程化进程，从最初的杂交瘤技术到噬菌体、细菌、酵母、哺乳动物与核糖体等复杂展示平台，每种方法都在亲和力成熟、表达保真度、文库多样性与筛选便捷性方面提供了独特优势。展示技术与单细胞组学、计算生物学的整合，已将抗体发现管线推向更个性化、更快速、覆盖更广治疗靶标的阶段。尽管技术不断进步，这些方法仍存在文库多样性有限、表达挑战、 scalability问题与生产成本高等局限，尤其是将展示获得的候选分子转化为生物制剂的阶段。但合成支架开发、宿主系统优化与微流控平台等技术创新正逐步解决这些问题。人工智能与深度学习算法和传统抗体工程的融合有望重新定义治疗性抗体的格局，AlphaFold、DeepAb、Rosetta等AI模型可实现精准结构预测与表位映射，大幅加速先导候选分子的优化；机器学习与高通量筛选平台的整合、AI驱动的湿实验室的出现，将推动下一代患者特异性抗体疗法在远短于传统开发周期的时间内实现设计。抗体发现的未来在于构建灵活平台，实现更快的先导分子生成与按需生产适配个体患者特征的生物制剂。随着单细胞测序、转录组学与数据分析的创新，研究人员可解析疾病异质性，设计更精准、稳定、有效的抗体。综上，持续投入涵盖分子生物学、免疫学、计算建模与抗体工程的交叉学科创新，对充分释放展示技术的治疗潜力至关重要。随着精准医疗的发展，抗体展示技术将引领生物制剂发现，架起实验室创新与临床应用的桥梁，通过明确技术进步与当前局限，本综述为改进抗体工程与治疗开发提供了前瞻性框架。
