一种无需扩增的CRISPR/Cas12a-纳米吸管电化学传感器，用于原位区分Salmo salar和Oncorhynchus mykiss

《Analytica Chimica Acta》：An Amplification-Free CRISPR/Cas12a–Nanopipette Electrochemical Sensor for In Situ Discrimination of Salmo salar and Oncorhynchus mykiss

　　

杨洋庚|方兆|贾阳|刘康|吴琳娜

南京师范大学食品科学与制药工程学院，中国南京210023

摘要

背景

Salmo salar（S. salar）和Oncorhynchus mykiss（O. mykiss）具有高度相似的形态特征，这经常导致市场上的掺假现象。这种表型相似性给使用传统分析方法进行准确的现场物种鉴定带来了重大挑战。

结果

在这项研究中，通过将CRISPR/Cas12a识别系统与单个纳米管集成，构建了一种无需扩增的电化学生物传感器，能够精确识别S. salar的DNA，而无需复杂的预处理。该策略基于目标DNA诱导Cas12a的转切割活性，Cas12a会切割固定在纳米管内壁的DNA报告分子，从而改变表面电荷，并通过离子电流整流（ICR）实现电化学读数。在优化条件下，该传感器的检测限低至0.11 pM，有效区分了O. mykiss的DNA，并表现出良好的重复性和稳定性。意义：这项工作提供了一种低成本的现场分析工具，用于水生物种的鉴定，可以在鲑鱼组织切片中直接进行原位检测，无需核酸扩增或复杂的样品预处理，从而有效填补了快速准确物种鉴定方面的技术空白。

引言

Salmo salar（S. salar）是一种备受重视的鲑鱼品种，因其优良的营养价值和强劲的市场需求[1]。然而，其高商业价值导致了频繁的掺假行为，通常使用形态相似且成本较低的Oncorhynchus mykiss（O. mykiss）作为替代品，从而引发了经济欺诈和潜在的食品安全问题[2]、[3]、[4]。因此，迫切需要可靠的物种鉴定方法。

目前，S. salar的鉴定方法主要分为两类：物理化学分析方法和分子生物学方法。物理化学方法基于样品的物理化学特性，通常包括基于质谱的指纹分析和组学分析[5]，以及同位素和元素指纹分析[6]、[7]。这些方法不依赖于核酸信息，但通常需要相对大量的样品和复杂的预处理程序，导致样品和试剂的消耗量增加。分子生物学方法，包括DNA条形码[8]、基于PCR的检测[9]和CRISPR/Cas技术[10]、[11]，通过靶向特定物种的核酸序列来实现物种鉴定。尽管这些方法具有高灵敏度，但它们通常依赖于DNA提取和扩增[12]、[13]。因此，现有的方法不适合现场食品检测的需求，因为在现场进行实时检测对于及时干预和防止欺诈至关重要。

最近的研究表明，将CRISPR/Cas系统与纳米管集成可以创建超灵敏的生物传感平台。纳米管具有圆锥形纳米级尖端和固有的几何不对称性，表现出离子电流整流（ICR）现象，这种信号对孔壁化学环境的微妙变化非常敏感，为无标记和高灵敏度的生物传感提供了理想的基础[14]、[15]、[16]。纳米管基传感器的高灵敏度源于纳米限制效应：在纳米管尖端的受限空间内，反应物的局部浓度显著增加，这可以显著提高酶促反应效率并放大可检测信号[17]、[18]、[19]。CRISPR/Cas12a系统具有可编程的目标识别和高效的转切割活性，是分子识别和信号放大的强大工具[20]、[21]。这种基于纳米管传感和CRISPR/Cas系统的组合在先前的研究中实现了蛋白质生物标志物和microRNAs的超灵敏检测[22]、[23]，证明了在纳米受限空间内的有效信号放大。然而，将这种高效的传感策略应用于食品真实性验证，特别是用于快速和现场检测特定物种的DNA序列，仍然很大程度上尚未探索。

因此，我们通过将Cas12a的目标激活转切割活性与单个纳米管的ICR响应集成，开发了一种无需扩增的电化学生物传感平台（图1）。在这种设计中，硫醇修饰的单链报告DNA（reDNA）被固定在纳米管的内壁上。当crRNA引导下识别目标DNA时，Cas12a被激活并表现出转切割活性，非特异性地切割固定的reDNA。这种切割降低了受限纳米通道内的表面电荷密度，从而改变了ICR特性，并产生了可测量的电流-电压（I–V）响应变化。通过将Cas12a介导的界面反应直接转换为电信号，这种策略实现了无需核酸扩增的快速无标记检测，同时仅需要最少的样品消耗。该设计允许将纳米管直接插入切片的鱼组织中进行原位实时分析，消除了DNA提取的需要，实现了即时读数。因此，该平台为快速现场区分S. salar和O. mykiss提供了实用的工具，满足了海鲜安全监管中对实时监控日益增长的需求。

章节片段

化学物质和材料

所有合成寡核苷酸（表1）均由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国南京）纯化。磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）粉末购自Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd.（中国江苏）。牛血清白蛋白（BSA）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。氯化镁（MgCl₂）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）和其他分析级无机盐由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.提供。

纳米管传感器的表征

拉出的纳米管具有圆锥形纳米级尖端结构。扫描电子显微镜（SEM）图像清晰地显示了纳米管尖端的整体形态和几何特征，经过金修饰的纳米管孔径约为155 nm（图1A和图1B）。通过SEM测量了五批独立纳米管（每批三个纳米管）的尖端孔径。如箱线图（图S1，支持信息）所示，整体平均值

结论

总之，我们开发了一种无需扩增的电化学生物传感平台，将CRISPR/Cas12a与单个纳米管集成，用于快速可靠地区分S. salar和O. mykiss，满足了海鲜市场监控中对实时现场物种鉴定的关键需求。通过利用纳米管尖端内的纳米限制效应来提高酶促反应效率，该策略将Cas12a介导的界面反应转换为

CRediT作者贡献声明

李娜吴：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。刘康：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、概念构思。贾阳：资源获取、正式分析。方兆：撰写 – 初稿撰写、验证、调查、数据管理。杨洋庚：撰写 – 初稿撰写、调查、正式分析、数据管理

利益冲突声明

作者确认没有可能影响本文研究的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划2025YFF1107701、江苏省重点大学科研项目（25KJA550001）和江苏省合成生物学基础研究基金（BK20233003）的支持。