综述：抗菌素耐药性与人类肠道微生物组——食品安全视角

《Critical Reviews in Food Science and Nutrition》：Antimicrobial resistance and the human gut microbiome—a food safety perspective

　　

胃肠道环境是常驻肠道微生物组遭遇食物源微生物、抗菌素耐药基因（Antimicrobial resistance genes, ARGs）和食物生物活性物质的场所，这些因素可能影响抗菌素耐药性（Antimicrobial resistance, AMR）的获得和传播。尽管在食品和食品生产环境中经常检测到耐药细菌和ARGs，但它们对肠道耐药组（resistome）的贡献尚不明确。大多数摄入的微生物是短暂的，并受到生态屏障的限制；然而，体内水平基因转移（Horizontal gene transfer, HGT）发生的条件尚未完全表征。多种因素（例如，微生物组成和密度、可移动遗传元件（Mobile genetic elements, MGEs）的存在、抗菌素残留和宿主生理学）可以调节ARGs的持久性和移动性，但它们在肠道生态系统及其相关耐药组中的相对影响需要进一步阐明。耐药性的获得还依赖于复杂微生物群落中的适应性代价（fitness costs）和适应性反应。方法学变异性和有限的体内数据进一步限制了结果的可比性和解释。本综述总结了关于饮食暴露后肠道中AMR动态的当前知识，并强调了限制研究人员对影响ARGs在胃肠道环境中转移和持久性因素理解的重大知识差距。减少这些不确定性对于加强AMR风险评估和设计更有效的缓解策略至关重要。

引言
抗菌素耐药性（AMR）是一个关键的全球健康问题，超越了临床环境，涵盖了整个食物生产连续体。食物链——包括初级生产（农业、水产养殖和畜牧业）、加工、分销和消费——既是耐药微生物和抗菌素耐药基因（ARGs）的储存库，也是其传播途径。AMR沿此链的动态受到复杂生态、技术和社会经济相互作用的影响，耐药细菌和基因通过食物、水、废物和直接接触在生态系统间移动。人类可以通过食用受污染食物、职业暴露（例如农业环境中的农民）和环境接触获得ARGs。虽然大多数摄入的细菌被认为是短暂的，但这些短暂细菌仍可通过水平基因转移（HGT）机制（如接合作用（conjugation））将ARGs转移给常驻肠道微生物，从而贡献于肠道耐药组。食物中耐药细菌的比例未知，取决于年龄、饮食和抗菌素治疗等因素。本综述旨在讨论AMR的一般概念、耐药获得和持久性的机制、肠道微生物组在AMR动态中的作用，以及相关化学和食物源AMR风险评估要素。在此背景下，综述概述了当前对AMR与饮食暴露关系的理解，特别检查了可能影响人类肠道微生物组内耐药动态的食物源微生物和受监管化学物质。
抗菌素耐药性——一般概念
抗菌素耐药性（AMR）是指“微生物在相对于同种易感微生物增加的抗菌剂浓度下增殖或存活的能力”（Codex Alimentarius 2011）。抗菌剂是“任何天然、半合成或合成来源的物质，在体内浓度下通过与特定靶点相互作用杀死或抑制微生物生长”（FAO et al. 2008）。耐药性可针对单一或多种化合物（例如多重耐药（multi-drug resistance, MDR））。抗菌素耐药性决定因素（antimicrobial resistance determinants）指“编码微生物抵御抗菌剂作用能力的遗传元件，位于染色体上或染色体外，并与可移动遗传元件（MGEs）相关，从而实现从耐药菌株向易感菌株的水平传播”（Codex Alimentarius 2011）。ARGs本身不赋予耐药性，而是编码它，因此是耐药潜力的指标。耐药表型（resistance phenotype）是在基因表达后观察到的耐药性。沉默基因（silent genes）或隐性基因（cryptic genes）在正常条件下不赋予表型耐药性，但可能被激活或转移。原型基因（proto genes）即使完全表达也不赋予抗生素耐药性，但具有进化为耐药基因的潜力。共同选择（co-selection）是指暴露于一种选择剂（如重金属）导致对第二种无关抗菌剂（如抗生素）耐药性的传播，机制包括共同耐药（co-resistance）和共同调控（co-regulation）。交叉耐药（cross-resistance）是指微生物因共享耐药机制而能对特定类别的多种抗菌剂增殖或存活。多种分子机制已被识别，包括抗菌剂的酶降解或失活、物质主动外排、抗菌靶位点修饰、靶点绕过、靶点保护和抗菌剂摄取减少。虽然后四种机制仅使单个微生物受益，但抗菌剂的酶失活在群落水平赋予耐药性。
肠道微生物组中的抗菌素耐药性
微生物组（microbiome）被定义为“占据具有独特物理化学特性的合理、明确栖息地的特征性微生物群落”（Berg et al. 2020），胃肠道（gastrointestinal, GI）是这样一个栖息地，主要由细菌、古菌、病毒和真菌组成。细菌群落由两个主要门主导：拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。其他重要门包括放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。肠道居民中，共生菌（commensals）提供有益功能而不致病；病原共生菌（pathobionts）在健康个体中不致病，但在特定条件下可能致病。肠道微生物组的病毒成分（virome）包括噬菌体（bacteriophages），据估计占肠道病毒组的90%以上，通过HGT影响细菌多样性和功能性。AMR在肠道中并非新现象，各种假定的ARGs已在古代粪便化石中发现。由于肠道中ARGs数量众多和细菌密度高，尤其是结肠，假设肠道微生物组作为耐药决定因素的储存库。肠道中ARGs的集合通常称为肠道耐药组（gut resistome），但耐药组概念因研究方面不同而有多种定义。尽管耐药组和微生物组看似同质，但GI道内环境和生理条件的变化显著影响不同生态位中微生物群落和ARGs的多样性和丰度。研究主要依赖粪便样本可能无法准确反映肠道微生物群和耐药组。在组学时代之前，耐药评估主要关注致病细菌菌株，依赖培养和PCR技术。宏基因组学（metagenomics）使焦点从特定细菌中搜索特定基因转向检测整个群体中的ARGs。研究设计的异质性、采样技术、DNA提取程序、测序平台、生物信息学流程和耐药数据库引入了分析变异性，导致有偏或不同的结果。
抗菌素耐药性机制
类型
AMR可以是固有的（intrinsic）或获得的（acquired），涉及的机制复杂多样。固有耐药性编码在细菌染色体中，不依赖于先前的抗生素暴露或细菌间遗传物质交换，包括革兰氏阴性菌的脂多糖外膜、天然存在的外排泵（efflux pumps）活性等。获得性耐药性可通过对压力触发的响应而获得，作为生存和适应的机制，包括突变（de novo resistance）或通过HGT获取遗传材料。从头耐药性（de novo resistance）源于染色体基因的自发突变，改变细菌蛋白质的结构和功能。HGT也称为侧向基因转移（lateral gene transfer），指在接近生物体之间交换遗传物质，通过接合作用（conjugation）、自然转化（natural transformation）、转导（transduction）和膜囊泡（membrane vesicles）等机制发生。接合作用是通过直接接触转移遗传物质的过程，由接合性质粒（conjugative plasmids）介导。自然转化是细菌摄取并整合环境中外源DNA的过程。转导是噬菌体在细菌细胞间转移遗传物质的过程。膜囊泡是革兰氏阴性菌通过释放膜囊泡转移耐药决定因素的机制。基因移动性（gene mobility）指基因在细菌基因组内和之间转移的能力，由可移动遗传元件（MGEs）如质粒（plasmids）、整合性接合元件（integrative conjugative elements, ICEs）、转座子（transposons）和整合子（integrons）促进。大多数研究聚焦于病原体和环境分离株，体内HGT研究有限。第三种类型与生物膜（biofilms）中的细菌生活方式相关。生物膜是嵌入宿主和微生物化合物组成的生物聚合物基质中的微生物聚集体。生物膜增强微生物生存，通过提供物理保护、促进HGT、容忍机制（包括持久细胞（persister cells））影响AMR。群体感应（quorum-sensing, QS）系统通过细胞信号分子协调微生物群落，在调节ARG表达、HGT、生物膜形成和定植抵抗中发挥作用。
限制HGT成功的因素
成功的耐药获得取决于多个因素。DNA摄取障碍包括细菌感受态（competence）和细菌免疫（bacterial immunity），如限制-修饰系统（restriction-modification systems）和CRISPR-Cas系统。限制-修饰系统通过限制性内切酶（REase）和甲基转移酶（MTase）区分自我和非自我DNA。CRISPR-Cas系统保护细菌免受外源遗传元件获取。遗传背景和宿主细胞兼容性涉及基因表达与受体细胞调控元件的兼容性，以及新基因与受体细胞生理和代谢活动的兼容性。适应性代价（fitness costs）包括能量消耗增加、代谢干扰等，可导致生长速率降低、增殖能力下降。细菌通过适应性过程（如补偿性突变（compensatory mutations））减轻适应性代价，维持耐药性。毒素-抗毒素（toxin-antitoxin, TA）系统由稳定毒素和不稳定抗毒素组成，可通过后分离杀死（post-segregational killing）机制维持质粒介导的耐药性。这些因素共同作用，限制HGT在复杂微生物群落中的成功。
肠道生态系统对微生物耐药性的影响
胃肠道（GI）道可视为动态生态系统生态位的总和，通过纵向和横截面的解剖结构、生理活动和波动环境条件定义。GI道不同部分的微生物多样性和生态条件变化可调节各区域的AMR动态。定植抵抗（colonization resistance）是健康常驻肠道微生物组提供的防御功能，通过竞争营养、产生抗菌物质（如细菌素（bacteriocins）、短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs））、改变环境条件和刺激宿主防御来限制外源细菌定植。环境变化和摄入的化学物质可能诱导细菌应激（SOS）反应，增强HGT活性。
影响人类肠道耐药组的因素
人类肠道耐药组由宿主、肠道微生物群和环境生物非生物因素之间的复杂相互作用塑造。宿主因素包括年龄和生理发育阶段，影响ARGs获得。健康状况变化，如炎症，可能促进HGT。环境因素包括家庭环境、地理差异和饮食因素。饮食因素中，食物源耐药微生物可在任何阶段接触食物，包括动物产品、植物源食品、发酵食品、益生菌（probiotics）和饮用水。食品中具有潜在（共）选择性的化学物质包括兽药残留（veterinary drug residues）、农药残留（pesticide residues）、杀菌剂（biocides）、重金属（heavy metals）和食品添加剂（food additives）。这些化学物质在亚抑制浓度下可能施加选择压力，促进耐药性出现或共同选择。
肠道中的抗菌素耐药性：双重角色？
AMR通常从临床风险角度看待，但在复杂肠道生态系统中，耐药相关性状也可能在微生物生态学中发挥超越传统理解的作用。固有的、染色体编码的、非移动耐药决定因素可能支持微生物弹性和生态系统稳定性，而不一定增加耐药传播风险。
抗菌素耐药性和肠道微生物组的风险评估
不同类型的AMR风险包括耐药出现风险、ARGs传播风险、共同选择风险和与ARGs相关的健康风险。ARGs风险等级划分框架（如Martínez等和Zhang等）基于ARGs在人类相关环境中的富集、基因移动性和人类ESKAPE病原体的存在等因素。Codex Alimentarius发布了应对食物源AMR风险的指南，包括危害识别、暴露评估、危害特征描述和风险特征描述四个主要组成部分。食品安全中受监管化学品的AMR风险评估涉及化学风险评估如何考虑微生物组，以及抗菌素耐药性在其中的角色。JECFA通过逐步决策树方法建立微生物可接受每日摄入量（mADI），考虑对肠道微生物组定植屏障的破坏和耐药肠道细菌的增加。技术限制和知识差距影响将微生物组数据整合到风险评估中。
结论
已知ARGs存在于肠道微生物组中，包括编码对最后手段抗生素耐药的基因。尽管AMR动态在临床环境、环境和初级食品生产中已广泛研究，但对胃肠道内AMR动态以及来自食物源的耐药细菌和抗菌素的相对影响的理解仍然有限。许多开放问题需要解决，例如食物源ARGs向肠道共生菌转移的概率、频率和机制；食品中允许水平的受监管化学剂是否促进HGT并（共）选择耐药性；耐药组变化是由于常驻细菌波动还是HGT事件；生物膜在AMR动态中的相对贡献；以及多药耐药是否是抗生素治疗失败的唯一原因。积极的是，有众多工具可最小化耐药在食物生产链中的出现和传播，包括最佳农业和食品制造实践、监测计划和基于风险评估框架的监管活动。尽管将肠道微生物组数据（包括AMR）用于风险评估有限，但它为未来推进和改进风险评估提供了巨大潜力。