集成DNA行走器与CRISPR-Cas13a系统的数字微滴微流控技术实现单个外泌体表面蛋白与miRNA的同步谱分析

《Biosensors and Bioelectronics》：Digital droplet microfluidics integrating DNA walkers and CRISPR-Cas13a for simultaneous surface protein and miRNA profiling in single exosomes

　　

肿瘤来源的外泌体携带多尺度分子特征（例如，表面蛋白和核酸）以反映肿瘤异质性，然而在单个完整囊泡中同步谱分析这些生物标志物在技术上仍然具有挑战性。在此，研究人员开发了一个数字微滴微流控平台，该平台集成了DNA行走器和CRISPR/Cas13a系统，用于在单个外泌体水平上同步检测表面蛋白（EpCAM、HER2）和miRNA（miR-21）。该平台采用工程化脂质体纳米探针（engineered liposome nanoprobes, eLipo-NPs），其外膜功能化了EpCAM适体和发夹探针（hairpin probes, HPs），并在其腔内封装了CRISPR/Cas13a系统。当与单个外泌体共封装进入液滴后，EpCAM介导的膜融合使HPs在杂交膜上重新分布并将CRISPR/Cas13a递送至外泌体内。膜锚定的DNA行走器随后结合HER2并驱动HPs的循环DNA酶切割以恢复红色荧光。同时，crRNA引导的Cas13a识别miR-21并触发报告子的反式切割以产生绿色荧光。双色液滴的数字计数实现了定量的单外泌体分析，其检测限（limit of detection, LOD）为10颗粒/μL，检测时间为60分钟，通量超过8 × 10³液滴/秒。使用来自24名乳腺癌患者和14名健康供体的血浆来源外泌体进行的临床验证显示，在HER2阳性、HER2阴性和健康对照组之间存在不同的分布，且双阳性液滴比例与临床HER2状态显著相关，突出了该平台在液体活检和精准肿瘤学方面的潜力。

肿瘤来源的外泌体已成为液体活检应用中有前景的生物标志物，其携带的分子特征反映了其细胞来源和肿瘤进展。然而，传统的检测方法（如酶联免疫吸附测定法（ELISA）、蛋白质印迹（Western blotting）和实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR））仅能测量大量外泌体群体，无法揭示对准确早期检测和精确亚型分类至关重要的分子异质性。为准确解读肿瘤异质性，需要超越单一分析物检测，在单个外泌体水平进行多尺度生物标志物谱分析。例如，在乳腺癌诊断中，同步共检测表面蛋白（如上皮细胞粘附分子（EpCAM）和人表皮生长因子受体2（HER2））和内部核酸（如miR-21）可提供多尺度分子特征。具体而言，HER2是一种可治疗性膜受体，定义了侵袭性乳腺癌亚型。然而，外泌体上的HER2表达可能具有异质性，在HER2低表达（如HER2 1+）背景下，弱膜信号可能与非肿瘤囊泡的背景重叠。因此，共检测广泛的上皮癌症标志物EpCAM为确认肿瘤来源提供了重要依据。为了进一步提供互补于膜受体量的正交囊内读出，研究人员选择了与肿瘤进展相关且常在肿瘤来源外泌体中富集的致癌微小RNA-21（miR-21）。尽管如此，同步多尺度单外泌体分析在技术上仍具挑战性，因为它需要单个囊泡的高通量分离和低丰度靶标的超灵敏信号放大。因此，迫切需要能够进行高灵敏度、高通量和多重单细胞细胞外囊泡分析的新型分析平台。

近年来，基于液滴的微流控技术已成为数字单颗粒分析的强大策略。通过将单个外泌体分隔到皮升至飞升级别的微反应器中，基于液滴的微流控技术显著提高了局部分析物浓度和分析通量。然而，当前基于液滴的单外泌体分析主要是单模态的，针对表面蛋白谱分析或核酸检测，但很少能在同一囊泡内同时测量两类生物标志物。最近，Lin等人开发了一个基于液滴的微流控平台，利用抗体-DNA偶联物和三重逆转录微滴数字聚合酶链式反应（RT-ddPCR），在单个外泌体水平上双重检测外泌体膜蛋白和mRNA。然而，该方法需要囊泡裂解，从而破坏了表面和囊内生物标志物之间的空间共定位。为解决此问题，Xu等人开发了一种数字双CRISPR-Cas检测（ddSEE），该检测整合了外泌体-脂质体融合与基于微孔的数字分区芯片，可在不裂解囊泡的情况下，在单个外泌体水平上同步检测表面蛋白和囊内miRNA。然而，在其设计中，融合主要作为通用的miRNA进入机制，而非一种生物标志物条件的门控步骤，该步骤选择性地允许对特定肿瘤相关外泌体亚群进行读出。

与此同时，核酸扩增和基于CRISPR的生物传感器已被广泛探索以提高分析灵敏度。然而，将这些扩增方法应用于完整囊泡、单外泌体共谱分析仍然具有挑战性，因为它需要（i）无需批量裂解即可选择性进入囊内靶标，（ii）保留标志物共定位的局部扩增，以及（iii）与低拷贝靶标兼容的数字分隔。

在此，研究人员开发了一种膜融合驱动的数字微滴微流控平台，该平台集成了膜锚定的DNA行走器与CRISPR/Cas13a系统，用于在单个外泌体水平上同步谱分析表面蛋白生物标志物（EpCAM，HER2）和囊内miRNA（miR-21）。研究人员选择HER2阳性乳腺癌外泌体作为代表性靶标。利用EpCAM介导的选择性融合作为门控事件，该平台能够进入囊内并共检测EpCAM阳性肿瘤外泌体亚群。具体而言，通过将EpCAM适体和DNA行走器轨迹（Cy5/BHQ2修饰的HPs）功能化到脂质体膜上，并在脂质体核心内封装CRISPR/Cas13a系统，构建了eLipo-NPs。eLipo-NPs与靶外泌体之间的EpCAM介导融合可启动两个平行且协同的信号放大通路。外部，游离的DNA行走器臂和融合诱导的膜流动性激活了DNA行走器，使其能够在脂质双层上行走，并在Mg²⁺存在下触发轨道底物的循环切割，从而呈指数级放大HER2蛋白信号并产生增强的红色荧光。内部，eLipo-NPs将封装的CRISPR/Cas13a系统递送至外泌体中，该系统识别靶标miR-21并触发反式切割活性，导致增强的绿色荧光。通过将这些复合物共封装到连续的微流控液滴中，研究人员能够在单个外泌体水平上实现两种靶标的高通量数字定量。该平台的检测限为10颗粒/μL，并已应用于检测临床样本中的HER2状态，区分HER2阳性乳腺癌外泌体、HER2阴性乳腺癌外泌体和健康对照。此外，所得的单外泌体谱可根据HER2状态进行分层以指示疾病进展。

研究人员首先验证了修饰脂质体的成功合成。通过F?rster共振能量转移（F?rster resonance energy transfer, FRET）脂质混合实验和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）可视化，验证了EpCAM适体-脂质体与SKBR3外泌体之间EpCAM介导的膜融合特异性，并优化了融合条件。

其次，研究人员验证了DNA行走器的性能。通过荧光动力学、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）分析以及与刚性金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）的对比，证实了膜融合触发的膜流动性驱动的DNA行走器能有效实现循环信号放大，用于HER2蛋白检测。

接着，研究人员验证了CRISPR-Cas13a系统对miR-21的特异性检测能力。通过PAGE和荧光实验，证实了系统对靶标miR-21的特异性识别和随后的报告子反式切割活性。

随后，研究人员在细胞系来源的外泌体上验证了平台同步检测多尺度生物标志物的能力。通过CLSM和纳米流式细胞术分析，证实了平台能够同时检测SKBR3外泌体上的EpCAM、HER2和miR-21，结果与预期一致。

然后，研究人员开发了基于液滴微流控的单外泌体数字分析。他们设计并制备了PDMS微流控芯片，通过优化液滴生成和单外泌体封装，建立了定量检测范围，获得了10颗粒/μL的检测限（LOD），并验证了平台的重复性和性能。

最后，研究人员进行了临床评估。通过分析来自24名乳腺癌患者和14名健康供体的血浆外泌体样本，发现双阳性（HER2+和miR-21+）液滴比例在HER2阳性乳腺癌患者中显著升高，并与临床HER2免疫组化（immunohistochemistry, IHC）状态显著相关，证明了平台能够有效区分健康供体、HER2阴性和HER2阳性乳腺癌患者。

在讨论部分，研究人员指出，该平台通过整合EpCAM介导的膜融合、HER2触发的DNA行走器和miR-21激活的CRISPR–Cas13a系统，实现了在单个外泌体水平上对表面蛋白和囊内miRNA的同步数字谱分析。EpCAM介导的融合充当了初始门控步骤，确保了分析的肿瘤来源特异性。DNA行走器和CRISPR-Cas13a系统提供了两种正交的、信号放大的读出方式，分别用于检测表面蛋白和囊内核酸。数字微滴分隔显著增强了信噪比，实现了定量分析。临床验证结果表明，该平台在乳腺癌HER2状态分型和患者分层方面具有显著潜力，为基于外泌体的精准肿瘤学提供了新的工具。

研究人员总结指出，他们开发了一种高通量数字微滴微流控平台，该平台通过集成EpCAM介导的膜融合、HER2触发的DNA行走器和miR-21激活的CRISPR–Cas13a系统，实现了在单个外泌体水平上对表面蛋白生物标志物（EpCAM和HER2）和囊内miRNA（miR-21）的同步谱分析。该微滴平台实现了动态范围为10–10⁵颗粒/μL、检测限为10颗粒/μL、总检测时间约60分钟、液滴生成通量约8 × 10³液滴/秒的数字单外泌体计数。涉及38名受试者的临床验证表明，该数字微滴微流控平台能够有效分类健康供体、HER2阴性和HER2阳性乳腺癌患者，且双阳性液滴的百分比与HER2状态显著相关（p < 0.0001）。尽管本研究受限于相对较小的队列规模、单中心样本来源以及受限的乳腺癌亚型分布，但研究结果证明了该平台在基于外泌体的患者分层和精准肿瘤学方面的强大潜力。为了进一步评估其实际转化可行性，研究人员估算每次测试的试剂成本为1.58美元。未来需要进行涉及更大规模、多中心队列且具有更广泛和平衡亚型代表性的研究，以进一步验证其临床性能和转化实用性。