《Biochemistry》：Deacetylation of β-Mannans by Two Complementary Carbohydrate Esterases from the Human Gut Microbe Bacteroides cellulosilyticus
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β-甘露聚糖广泛存在于植物源性食品及食品添加剂中，其乙酰化修饰是决定理化性质及抗酶解特性的关键因素。既往针对芽孢杆菌门（Bacillota）成员的乙酰化β-甘露聚糖解聚机制已有较深入解析，而拟杆菌门（Bacteroidota）对该类聚糖的利用机制仍不明确。研究
β-甘露聚糖广泛存在于植物源性食品及食品添加剂中，其乙酰化修饰是决定理化性质及抗酶解特性的关键因素。既往针对芽孢杆菌门（Bacillota）成员的乙酰化β-甘露聚糖解聚机制已有较深入解析，而拟杆菌门（Bacteroidota）对该类聚糖的利用机制仍不明确。研究人员结合蛋白质组学与生化分析，对纤维拟杆菌（Bacteroides cellulosilyticus）中一对协同作用、可完全去乙酰化复杂β-甘露聚糖的碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases, CEs）进行了功能表征。研究发现，新鉴定的BcCE25属于全新CE家族，对甘露糖残基轴向取向的2-O-乙酰基具有高度特异性；而BcCE7为广谱酯酶，可对多种结构底物的寡糖进行去乙酰化。该研究揭示了有益拟杆菌在人类肠道中进化出的复杂β-甘露聚糖去乙酰化策略，为理解肠道微生物的碳源利用机制提供了新的分子层面证据。
该研究发表于生物化学领域期刊《Biochemistry》，围绕人类肠道共生菌纤维拟杆菌（Bacteroides cellulosilyticus）降解乙酰化β-甘露聚糖的分子机制展开。研究背景显示，β-甘露聚糖作为半纤维素的重要组分，既是植物性食品的结构成分，也是常用的食品稳定剂、增稠剂和胶凝剂，其乙酰化程度直接影响溶解性与凝胶特性。膳食β-甘露聚糖可被肠道菌群发酵生成短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs），对宿主健康具有潜在益处。然而，乙酰化修饰会阻碍糖苷水解酶的催化活性，因此碳水化合物酯酶（CEs）的去乙酰化作用是完整降解过程的限速步骤。目前，针对芽孢杆菌门（Bacillota）成员中CE2、CE7和CE17家族的功能已有报道，但拟杆菌门（Bacteroidota）如何利用乙酰化β-甘露聚糖的机制尚不清晰，且缺乏对新酯酶家族的系统鉴定。
研究人员通过蛋白质组学筛选发现，当纤维拟杆菌以乙酰化软木葡甘聚糖（acetylated galactoglucomannan, AcGGM）或魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan, KGM）为唯一碳源生长时，会特异性上调一个包含两种酯酶基因的多糖利用位点（polysaccharide utilization locus, PUL）。随后，研究人员在大肠杆菌中重组表达了BcCE7和BcCE25蛋白，并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-ToF MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）及结构生物学预测等手段，系统解析了这两种酶的底物特异性、位置偏好性及催化动力学特征。
关键技术方法包括：以纤维拟杆菌DSM 14838为研究对象，在无碳源限制培养基中分别以葡萄糖、AcGGM和KGM为单一碳源进行体外培养；采用无标记定量蛋白质组学（label-free quantification, LFQ）技术比较不同碳源条件下的蛋白表达差异；通过异源表达纯化获得重组BcCE7和BcCE25蛋白；利用MALDI-ToF MS检测酶促反应产物质量变化，结合一维及二维NMR技术确定乙酰基取代位点；借助AlphaFold数据库预测蛋白三维结构并进行比对分析；采用对硝基苯酚乙酸酯（pNP-acetate）及天然AcGGM底物测定酶促动力学参数。
研究结果如下：
复杂β-甘露聚糖诱导包含两种酯酶的多糖利用位点。研究人员证实纤维拟杆菌可在以AcGGM或KGM为唯一碳源的培养基中良好生长。蛋白质组学数据显示，共有14个与β-甘露聚糖摄取和降解相关的蛋白显著上调，这些蛋白编码基因共同组成一个甘露聚糖利用位点（mannan utilization locus, MUL）。该位点除编码β-甘露聚糖酶、转运蛋白和α-半乳糖苷酶外，还包含两个酯酶基因：已知家族的BcCE7和此前未表征的BcCE25。同源分析表明，BcCE25属于SGNH水解酶超家族，在CAZy数据库中无已知对应家族，被鉴定为新家族CE25。
纤维拟杆菌酯酶的底物测试。单独处理时，BcCE7和BcCE25均可部分去除AcGGM上的乙酰基，而两者联合则实现了完全去乙酰化。BcCE7表现出广谱酯酶活性，可作用于乙酰化木聚糖和乙酰化纤维素；BcCE25则对乙酰化木聚糖和乙酰化纤维素活性较低。两者均无法作用于N-乙酰化的几丁寡糖。
纤维拟杆菌酯酶的位置特异性。利用已知位置特异性的参照酯酶制备特定位点乙酰化的甘露四糖底物，研究人员发现BcCE7对3-O-乙酰化和2-O-乙酰化均有活性，但后者效率较低；BcCE25则高效专一地去除2-O-乙酰基。转酯化实验进一步证实，BcCE25可催化乙酰基、丙酰基和丁酰基转移至甘露寡糖，且具有更高的底物容纳性，甚至可对高分子量KGM进行转乙酰化修饰。
结构分析与催化特性。AlphaFold结构预测显示，BcCE7与已表征的CE7家族成员结构高度相似，具有保守的催化三联体Ser281-Asp363-His392；BcCE25与芽孢杆菌门的RiCE17虽整体折叠不同，但催化中心（Ser37-His241-Asp238）和氧阴离子口袋（Asn134）空间排布保守。动力学分析表明，在以天然AcGGM为底物时，BcCE25的表观转换速率是BcCE7的10倍，且两者联用无协同效应，分别作用于不同的乙酰基子集。
研究结论指出，该研究首次在拟杆菌中发现了一对功能互补的酯酶系统，其中BcCE25作为全新CE家族成员，填补了拟杆菌门缺乏高效2-O-乙酰甘露聚糖酯酶的研究空白。这一发现不仅完善了拟杆菌β-甘露聚糖降解途径的分子模型，也提示β-甘露聚糖的乙酰化修饰在膳食中比现有认知更为普遍，为理解肠道微生物与宿主共进化过程中的碳源竞争机制提供了重要依据。
