《Physiology and Molecular Biology of Plants》：Alfalfa and M. truncatula TILLING lines divergent for nutritive value-related traits enable the identification of novel candidate genes by genotyping by Sequencing approach
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紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是饲草作物中主要的蛋白质来源，茎形态与开花时间是调控紫花苜蓿叶茎比及饲草营养品质的核心性状。研究人员针对开花时间与茎节间长度开展育种改良，经自交获得6份窄遗传基础紫花苜蓿品系，分别表现为早花（EF）与晚花（LF）
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是饲草作物中主要的蛋白质来源，茎形态与开花时间是调控紫花苜蓿叶茎比及饲草营养品质的核心性状。研究人员针对开花时间与茎节间长度开展育种改良，经自交获得6份窄遗传基础紫花苜蓿品系，分别表现为早花（EF）与晚花（LF）表型；同时培育出茎形态分化的合成群体，即长节间（LI）与短节间（SI）群体。此外，研究纳入2份开花时间分离的四倍体蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Mt）TILLING突变体品系，采用基于测序的基因分型（GBS）技术挖掘上述性状的遗传变异（单核苷酸多态性，SNP）。结果显示，紫花苜蓿EF与LF品系间共鉴定到57个SNP，其中13个在至少2组比较中共有，5个位于外显子区域并导致氨基酸改变；蒺藜苜蓿突变体品系中，EF与LF个体分别鉴定到49个与16个SNP，其中20个与7个位于外显子并引起氨基酸变化；LI与SI合成群体共鉴定到14个SNP，其中1个导致氨基酸改变。功能注释显示，转录因子及参与DNA、RNA和蛋白质修饰、调控与重塑，糖与脂质生物合成通路的基因占比最高。核与细胞器（尤其是叶绿体）的功能互作被证实是紫花苜蓿早熟性分化的关键机制。部分鉴定到的基因与目标性状显著相关，其中含五肽重复序列蛋白MtrunA17Chr1g0199691（调控开花时间）与MtrunA17Chr3g0128551（调控茎形态）被确定为苜蓿属遗传改良的潜在候选基因。
本研究聚焦紫花苜蓿饲草营养品质遗传改良这一产业需求，针对当前紫花苜蓿叶茎比低、收获期营养品质下降快的问题，系统解析了开花时间与茎形态对营养品质的调控机制。紫花苜蓿作为全球最重要的蛋白饲草，其叶片集中了植株大部分蛋白质，但随生育进程推进，茎秆木质化程度升高、蛋白质含量下降，导致整体营养品质降低。现有研究已明确茎形态（节间长度、节数）与开花时间共同决定叶茎比，但相关性状的遗传基础尚未完全解析，限制了分子育种效率。为此，研究人员构建了遗传分化显著的紫花苜蓿早花/晚花品系、长节间/短节间合成群体，并结合蒺藜苜蓿TILLING突变体资源，通过基于测序的基因分型（GBS）技术挖掘控制上述性状的关键SNP与候选基因，为苜蓿品质遗传改良提供理论支撑。该研究成果发表于《Physiology and Molecular Biology of Plants》。
研究人员采用的关键技术方法包括：1. 育种材料创制：通过2代自交与表型选择，结合杂交聚合，构建6份窄遗传基础紫花苜蓿早花/晚花品系及对应4亲本合成群体，以及长节间/短节间合成群体；从蒺藜苜蓿TILLING突变库中筛选开花时间分离的M3家系。2. 表型鉴定：在防雨棚与田间条件下，对株高、节间长度、开花时间（移栽至首花天数，DAT）、干物质产量（DMY）等指标进行多环境评价。3. 遗传变异检测：采用GBS技术进行高通量测序，利用Legpipe2流程进行SNP calling，结合等位基因频率差异筛选与目标性状连锁的SNP。4. 功能分析：通过Blast2GO与ShinyGO进行基因本体论（GO）富集分析，利用AlphaFold v3与DUET服务器预测非同义SNP对蛋白质三维结构的稳定性影响。
研究结果如下：
表型特征：紫花苜蓿晚花品系平均开花时间显著晚于早花品系，干物质产量更高；短节间合成群体较之长节间群体，营养节数增加1个，平均节间长度缩短，总株高降低，生殖生长转换延迟。蒺藜苜蓿2份突变体中，分离群体2345有3/20植株开花延迟（DAT 47.67±0.33），纯合群体1739中18/20植株显著晚花（DAT 37.11±0.44）。
序列分析与候选基因鉴定：紫花苜蓿早花/晚花比较共鉴定77个SNP，其中14个在至少2组比较中共有，5个为非同义突变，涉及花粉发育、脂质转运等功能；长节间/短节间比较鉴定14个SNP，1个为非同义突变，编码受体样激酶RLK-PelleLRR-III。蒺藜苜蓿1739与2345群体分别鉴定49个与16个显著SNP，其中22个与7个导致氨基酸改变，包含大量转录因子家族成员。
基因本体论分析：91个携带显著SNP的基因中，35个来自紫花苜蓿，56个来自蒺藜苜蓿，覆盖生物过程、细胞组分与分子功能三大类别。分子功能富集显示磷酸甘露糖变位酶活性（GO:0004615）、ATP柠檬酸合酶活性（GO:0003878）等通路显著富集，核与细胞器（尤其叶绿体）功能互作相关基因占比最高。
蛋白质结构破坏分析：34个非同义SNP中，2个导致终止密码子提前出现；蒺藜苜蓿中3个基因的突变导致蛋白质自由能变化（ΔΔG）低于-1.0 kcal/mol，提示结构稳定性显著降低。
讨论部分指出，本研究未发现已知开花调控核心基因（如MtPHYA、MtFTa1）的显著变异，但鉴定到大量新型候选基因。转录因子（占19.8%）是最丰富的功能类群，包括CCHC锌指蛋白、NAC家族、AP2/ERF家族等，其功能与拟南芥同源基因在开花调控中的作用一致。五肽重复序列蛋白（PPR）参与细胞器RNA加工，其中MtrunA17Chr8g0393341的结构破坏可能通过调控FLC表达影响开花时间。糖代谢基因MtrunA17Chr1g0199691编码磷酸甘露糖变位酶，参与抗坏血酸合成，进而调控赤霉素与脱落酸信号通路，是开花时间的潜在调控因子。茎形态相关候选基因MtrunA17Chr3g0128551编码ERECTA-like受体激酶，其突变可能导致短节间表型，与黄瓜、甜瓜中同源基因功能保守。
研究结论表明，窄遗传基础紫花苜蓿品系可有效用于复杂性状的遗传变异挖掘，核-叶绿体功能互作是早熟性分化的核心机制。鉴定的MtrunA17Chr1g0199691与MtrunA17Chr3g0128551是苜蓿品质改良的优质候选基因，结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术可实现精准育种，同时为豆科作物生殖发育与株型调控研究提供了新的基因资源。
