综述：冷冻干燥稳定策略与前沿进展：维持下一代生物制剂的结构完整性与药效

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Stabilization strategies and advancements in lyophilization to preserve integrity and efficacy of next-generation biologicals

　　

COVID-19大流行期间mRNA-脂质纳米粒(LNP)疫苗的成功研发显著提升了全球对稳定、耐热型生物制剂的需求。冷冻干燥仍是提升此类制剂稳定性的核心技术，但冷冻与干燥过程会产生显著应力，可能破坏脆弱LNP的结构完整性。本综述系统阐释了冻干保护剂（包括糖类、多元醇、氨基酸及聚合物）缓解冰诱导变性、脱水驱动聚集及界面失稳等挑战的分子机制，强调优化蔗糖-海藻糖复配体系与有效冰成核控制在维持包封效率与颗粒完整性中的关键作用。此外，综述探讨了数字孪生建模与共焦拉曼光谱等先进工艺优化工具的应用——这些工具可在保障关键质量属性的前提下，将一次干燥时长缩短至多40%。同时，本文重点介绍了利用新型辅料组合实现病毒载体冷藏储存的新兴应用。鉴于85%的商业偶联药物依赖冷冻干燥，连续冷冻干燥技术（如旋转冷冻法）的最新进展已将循环时长缩短至传统工艺的三分之一。上述进展为突破冷链限制、满足下一代生物制剂、CRISPR基因编辑系统及个性化药物的稳定需求提供了系统性路线图。

1. 1.
   引言
   生物制剂相较于低分子量药物在治疗危及生命疾病方面具有显著治疗优势。COVID-19大流行期间，基于脂质纳米粒(LNP)技术的信使RNA(mRNA)疫苗得以快速开发。尽管此类RNA-LNP疫苗具有良好的疗效与安全性，但其固有稳定性较差，运输与储存需依赖冷链与深冻条件。为突破这一限制，冷冻干燥已成为生物制药开发中提升药物稳定性的关键策略。冷冻干燥（冻干）包含三个阶段：冷冻（含退火）、一次干燥与二次干燥，通过升华作用从冻结液态制剂中去除水分。然而，冷冻与干燥过程产生的物理化学应力会损害最终产品的稳定性，因此必须采用优化冻干工艺及添加稳定剂（包括糖类、多元醇、氨基酸、聚合物与表面活性剂）等稳定策略。为进一步提升产品稳定性，研究人员开发了多种冻干策略，既包括质量源于设计(QbD)与实验设计(DoE)等传统方法，也涵盖数字孪生技术等创新手段，旨在优化产品与工艺性能。此外，需精细调控冻干参数以提升生物制剂稳定性——由于生物制剂对生产条件高度敏感，从处方设计、工艺开发到运输储存的全流程均需严格管控。为此，研究人员开发了实时监测技术等多种分析工具以优化冻干工艺参数。稳定性通常通过评估粒径及分布、表面电荷、药物保留率、残留水分、塌陷温度、饼状物外观与复溶时间等关键质量属性进行评价。本综述通过整合生物物理学与材料科学等多学科见解，系统梳理了LNP与蛋白质制剂在冻干应力下的现有研究，明确了结构-稳定性关系认知的关键缺口，并提出未来研究方向框架。研究强调了脂质组成、粒径、蛋白质折叠模式及冻干保护剂选择对制剂冻干稳定性的关键影响，倡导采用先进分析技术解析上述关系，最终推动更具韧性的生物制药产品的理性设计。本工作旨在通过结合数字孪生、人工智能/机器学习(AI/ML)、在线过程分析技术(PAT)等先进工艺优化工具，提升LNP与蛋白疗法稳定性，进而改善患者创新疗法的可及性与临床治疗效果。
2. 2.
   冷冻干燥与稳定剂的作用
   2.1 冷冻干燥力学机制
   冷冻干燥通过升华作用去除水分以保存生物制剂，包含冷冻、一次干燥与二次干燥三个阶段。冷冻过程中冰晶形成引发冻结浓缩，溶质浓度持续升高，黏度显著增加，pH可能发生偏移，进而抑制进一步结冰。与单一蛋白药物不同，mRNA-LNP与病毒载体等复杂组装体对冰晶机械应力及冰-水界面表面变性高度敏感，可能导致脂质膜破裂、药物泄漏或衣壳解离。干燥阶段通过脱水作用以保护性玻璃态基质替代水合层。对于复杂生物制剂，维持结构-稳定性关系至关重要：LNP的稳定性不仅取决于蛋白质折叠，还与脂质组成、粒径及表面电荷直接相关。理解这些结构特征在液-固相变过程中与辅料的相互作用，是理性设计下一代韧性产品的核心。为促进高效干燥，可通过调控冷冻速率与温度形成低比表面积的大尺寸冰晶。冷冻阶段生物制剂面临多重应力，包括低温、冷变性、浓缩效应、冰-水界面、离子强度变化、pH偏移与相分离，主要由相分离过程中溶质冻结浓缩引发的局部组分改变导致。例如，冰-水界面形成可能促进蛋白质吸附，诱导天然结构变性；冰晶形成伴随溶质浓度显著升高，可能损害活性药物成分稳定性；缓冲盐选择性结晶还会改变pH与离子强度。上述环境变化通过机械应力、溶质浓缩、pH波动、相分离等路径，最终导致药物泄漏与颗粒聚集，造成终产品失效。
   为确保工艺设计的科学性，需明确三个关键临界温度：本体制剂玻璃化转变温度(T_g)代表干燥无定形固体从刚性玻璃态向流动橡胶态的转变点，储存阶段需避免该转变以防止不稳定；最大冻结浓缩溶液玻璃化转变温度(T_g')发生于冷冻阶段，此时剩余非冰相黏度极高，阻碍水分子进一步结晶；塌陷温度(T_c)则是冷冻基质无法支撑自身重量而发生宏观或微观塌陷的温度。T_g'与T_c密切相关，但T_c通常比T_g'高数摄氏度，是维持饼状物完整性的实际一次干燥温度上限。一次干燥阶段通过降低腔室压力实现冰升华，产品温度(T_p)虽无法直接控制，但需始终低于T_g'以防止塌陷；二次干燥则通过升高搁板温度去除残留水分，此阶段结合水脱附过程会使制剂T_g进一步升高，允许在更高温度下进行干燥而不损害产品完整性。干燥阶段的另一核心应力为脱水作用：氢键对维持生物制剂结构与稳定性至关重要，为分子识别、蛋白质折叠及整体结构提供定向相互作用。水合层缺失会导致蛋白质变性，质子转移至电离羧基会降低蛋白电荷，促进疏水相互作用引发聚集。对于核酸类药物，脱水同样会影响RNA-LNP稳定性——LNP内部约24%(v/v)的水域容纳遗传物质，稳定剂除提供玻璃态基质外，还需通过特异性氢键直接保护内部脂质-RNA组装体。储存阶段的稳定性受温度、制剂玻璃化转变温度、pH、含水量及辅料类型共同影响，常见降解机制包括聚集、化学降解、美拉德反应、氧化、脱酰胺与水解等。

2.2 稳定剂的作用

为维持复杂生物制剂在冻干及长期储存中的稳定性，添加稳定剂至关重要，其功效具有显著的剂型特异性。糖类（如蔗糖）通过水替代效应稳定蛋白质，但在LNP体系中还需维持脂质组装体的内部水域结构；氨基酸（如精氨酸）在高浓度单克隆抗体(mAb)中主要用于降低黏度与提升溶解度，而在病毒载体与LNP中则需限制离子型辅料以避免降低T_g或引发pH偏移破坏颗粒静电稳定性。

2.2.1 糖类与多元醇

糖类与多元醇（蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇等）是应用最广泛的冻干保护剂，其稳定机制包括水替代、玻璃态稳定、基质致密化及创造类水环境。水替代是最主要的机制：稳定剂替代蛋白质周围的水分子，维持干燥过程中的必需水合层，防止变性聚集；玻璃态基质则将生物分子固定化，降低其流动性与环境应力敏感性。糖类效果通常与其浓度相关，糖-蛋白重量比最低需达1:1，最优范围为3:1至5:1，但过高浓度会导致结晶风险。二糖（如蔗糖）因玻璃化转变温度(T_g)高于单糖，稳定效果更优，但过高的空间位阻会削弱与干燥产物的氢键结合能力，需平衡T_g与氢键结合能力。

2.2.2 氨基酸

氨基酸通过增强溶解度、降低黏度、氢键作用、优先相互作用、调节分子流动性及缓冲抗氧化等多途径稳定生物制剂。精氨酸与精氨酸盐酸盐是研究最深入的氨基酸，可显著提升蛋白溶解度并降低溶液黏度。此外，氨基酸还可通过氢键与优先水合作用维持蛋白质天然构象，其缓冲能力可防止pH诱导的变性。但氨基酸的T_g相对较低，单独使用效果有限，常与糖类复配以提升整体制剂稳定性。

2.2.3 聚合物

聚合物（环糊精、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等）通过竞争性抑制、空间排斥与优先排斥机制提升生物制剂稳定性。例如PEG与葡聚糖可在蛋白质周围形成保护基质，阻止聚集并维持储存期结构完整性；其较高的T_g允许在更高温度下进行干燥，提升长期稳定性。部分聚合物还可与蛋白质形成氢键以维持天然构象，对易变性敏感生物制剂尤为重要。

2.2.4 表面活性剂

表面活性剂通过降低气-液、液-固或固-气界面张力，抑制蛋白质在界面处的吸附与变性聚集。非离子型表面活性剂（聚山梨酯、泊洛沙姆）可有效抑制液态与冻干产品的聚集。其稳定机制包括优先结合与表面活性剂-蛋白质复合物形成，阻止蛋白质间相互作用。除抑制聚集外，表面活性剂还可降低界面张力，促进稳定乳剂形成，在食品、化妆品与制药领域均有广泛应用。

2.3 稳定剂的应用

除传统辅料外，新型稳定剂的开发成为研究热点。例如乳清蛋白、胶束酪蛋白与菊粉复配蔗糖可提升冻干乳酸菌的长期存活率；超支化聚(3-(环氧乙烷-2-基甲氧基)丙烷-1,2-二醇)作为一种新型聚合物稳定剂，可通过独特拓扑结构增强水合并与制剂形成强相互作用，维持mRNA与自扩增RNA-LNP的生物完整性。针对RNA类治疗药物，文献报道的稳定剂体系主要包括：蔗糖-海藻糖-甘露醇复配体系可将mRNA-LNP的共晶点与塌陷温度提升，实现2-8°C储存1个月理化性质稳定；环糊精、甘露醇与蔗糖复配可有效稳定siRNA-LNP；5%海藻糖可使microRNA(miRNA)在30°C下维持6个月的功能活性；麦芽糖与蔗糖复配可使mRNA-LNP在4°C下稳定储存12个月。这些案例充分体现了稳定剂选择的剂型适配性。

1. 3.
   先进处方设计
   3.1 基于玻璃化的处方设计
   玻璃化是冷冻阶段溶液转变为玻璃态固体的过程，可阻止破坏性冰晶形成，保护生物制剂免受氧化、水解与聚集等环境应力。根据玻璃化理论，生物制剂与辅料形成无定形而非结晶态固体是确保稳定性的核心。制剂T_g需优化至高于储存温度，玻璃态基质可限制分子流动性，最小化降解风险。海藻糖作为典型玻璃化保护剂，可通过水替代假说（替代水分子形成氢键）、高亲液性（破坏冰生长所需网络）与化学稳定性（避免副反应）三重机制维持生物样品结构完整性与功能活性。无定形辅料（海藻糖、葡聚糖）可抑制结晶，促进玻璃化形成；结晶会导致生物分子被排除出晶格，引发聚集与活性丧失。为实现稳定玻璃态，需严格控制冷冻与干燥速率：优化的干燥速率可在不破坏无定形结构的前提下去除残留水分，残留水分过高会降低制剂T_g，需通过延长低压二次干燥或添加硅胶等吸湿材料进一步降低含水量。

3.2 冷冻干燥中的可控成核

可控成核是指人为调控冷冻阶段冰晶形成的起始过程，旨在获得均匀冰晶尺寸，提升一次干燥效率并维持产品结构完整性。通过超声、机械振荡、加压冷冻、真空诱导表面冷冻(VISF)与冰雾法等技术可实现可控成核，减少大尺寸冰晶对产品物理结构的破坏。退火处理（将冷冻产品置于略低于熔点的温度下保温）可促进冰晶重排与生长，提升冻干产品均一性。辅料会显著影响溶液热力学性质，进而影响成核与结晶行为；聚合物与表面活性剂可修饰结晶动力学，提升冻干产品稳定性。甘露醇作为常用填充剂需控制其结晶过程，避免无定形相塌陷——采用-45°C→-25°C梯度退火结合2% w/v甘氨酸可形成均匀结晶基质，将复溶时间缩短30%。尽管可控成核技术已取得进展，但甘露醇结晶损害结构完整性、高残留水分促进结晶、工业规模精准控温难度大、生物制剂多样性增加工艺复杂度等问题仍待解决。

3.3 结构稳定性

当前LNP与蛋白质制剂在冻干应力下的结构-稳定性关系研究仍存在显著缺口。LNP的脂质组成、粒径与表面电荷等结构特征深刻影响其冻干应激响应：脂质组成决定纳米粒膜的流动性与通透性，粒径与表面特性决定其与辅料及稳定剂的相互作用；蛋白质则对冷冻干燥应力高度敏感，易发生变性或聚集，其结构完整性受折叠模式、疏水相互作用与翻译后修饰的共同调控。海藻糖相比蔗糖与羟乙基淀粉(HES)-蔗糖复配体系表现出更优异的保护性能：其T_g为-30°C，可降低40%聚集率且糖基化风险低；非还原性特征可避免热敏疫苗发生糖基化反应，在25°C储存条件下比蔗糖降低90%糖基化率，并形成稳定无定形基质降低相变界面应力。5% w/v海藻糖可使纳米颗粒在40°C下维持6个月的分散均一性（多分散指数(PDI)<0.2），已被用于世界卫生组织预认证的mRNA-LNP COVID-19疫苗，支持资源匮乏地区的分发。HES-蔗糖复配体系（1:1）通过在冷冻阶段形成多孔刚性基质，将IgG1单克隆抗体聚集率降低40%，同时缩短15%的一次干燥周期，目前已应用于阿达木单抗生物类似药，将货架期延长至36个月以上。新兴仿生材料（如缓步动物CAHS蛋白）可将残留水分降至0.15%，并在50°C下维持18个月的酶活性；DNA折纸支架可通过精确三维纳米结构防止蛋白质展开，进一步提升热稳定性。

3.4 界面稳定性

表面活性剂通过界面稳定机制保护生物制剂：两亲性分子在气-水界面吸附形成保护层，阻止蛋白质与空气直接接触，减少变性聚集；同时与蛋白质疏水区域相互作用，维持冻干应力下的天然构象。非离子型表面活性剂（聚山梨酯80、泊洛沙姆188、维生素E TPGS等）可有效屏蔽冰-水界面对蛋白质的损伤，其中聚山梨酯80（0.01-0.05%）与普朗尼克F68（0.02-0.1%）可阻断冰-水界面诱导的蛋白暴露，维生素E TPGS（0.005-0.02% w/v）可降低高浓度mAb的气-水界面张力。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)可作为传统聚山梨酯的功能替代物，提升mAb制剂稳定性。近年来生物表面活性剂因可持续性优势成为研究热点，但其潜在电荷相互作用与高压灭菌下的稳定性仍需深入评估。

3.5 缓冲体系与离子型辅料的影响

缓冲体系用于维持生物制剂稳定的pH环境，其选择直接影响制剂稳定性与溶解度。磷酸盐缓冲液兼容性广但冷冻过程易发生pH偏移；枸橼酸盐缓冲液适用于偏酸性制剂（pH 3-6），可抑制蛋白聚集；组氨酸缓冲液因能有效维持蛋白结构完整性并减少聚集，在pH 5-7范围内应用日益广泛。离子型辅料通过调节离子强度、影响蛋白溶解度与冷冻行为发挥稳定作用，但高浓度盐会提升离子强度，反而损害蛋白稳定性。新型氨基酸缓冲体系（如精氨酸）可降低高浓度制剂的黏度；环糊精类化合物可通过包合蛋白疏水区域抑制聚集。对于mRNA-LNP，苹果酸缓冲体系在pH 3、无NaCl条件下可实现最高包封率（~45-50%）、最均匀粒径分布（PDI~0.10）与最小粒径（~115 nm），而高盐浓度会抑制包封并增大粒径。

3.6 基于人工智能的处方设计

3.6.1 机理与第一性原理框架

Michael J. Pikal建立的非稳态传热传质模型为预测产品温度奠定了物理基础，包括基于Excel的二次干燥机理模型，可在无需专用软件的情况下理性预测残留水分演变。这些机理框架（如考虑腔壁与瓶间辐射交换的漫灰表面模型）是现代数字孪生系统的物理“地面真值”，可与实时在线PAT同步实现自主生物制造。都灵理工大学团队开发的简化机理框架（如LyoPRONTO开源工具）显著提升了传统批次冻干的稳健性，结合Luenberger观测器可通过温度测量与传热/脱附动力学机理估算结合水浓度，无需直接浓度检测。

3.6.2 预测性稳定的AI与机器学习应用

数字高通量筛选(HTS)结合AI/ML可将候选制剂筛选周期从传统的6-8周压缩至约72小时，处理超过1200个候选处方。基于3D图分析的预测模型对稳定剂的稳定性预测精度（均方根误差RMSE）低至0.17；基于28000条蛋白质序列训练的模型可识别出使mAb聚集率降低63%的9聚肽。联邦学习可使八家制药企业的HTS成本降低41%，量子机器学习已用于新型稳定剂的理性设计与专利申请。欧盟LyophAI项目通过区块链数据共享实现了1.4亿个处方的虚拟筛选，傅里叶域低相干干涉术可量化10-500 μm范围内的饼状物孔隙率，冷冻电镜可解析一次干燥阶段2.8 ?分辨率的蛋白簇集行为。

3.6.3 集成PAT的自主制造

实时PAT与建模的结合已显著提升工艺效率：数字孪生建模结合在线拉曼光谱可使一次干燥时间缩短至多40%，同时保障关键质量属性。机器人工作站（如Hamilton MICROLAB? NGS系统）可实现每日5000个处方的高通量处理，玻璃化转变预测精度达0.92。通过求解代数偏微分方程可实现冻干与其他单元操作的全程模拟，一次干燥时间与塌陷温度的预测偏差可控制在±3.